目的:第一部分建模并验证不可逆电穿孔（irreversible electroporation,IRE）治疗骨转移瘤的有效性、安全性、局部免疫及生物效应机理机制。第二部分针对骨转移瘤设计手术方案,比较不同针距及不同脉冲发射方式引起的消融效应关系。方法:第一部分:不可逆电穿孔消融神经旁骨转移瘤的有效性、安全性、局部免疫及生物效应机制研究采用组织包埋法建立兔骨转移肿瘤模型,后选取25只荷瘤兔,分为观察组及解剖组。观察组中选取14只荷瘤兔,分为2小组,一组为对照小组,一组为IRE小组,每组7只。IRE小组于左侧腹股沟股骨旁近神经血管处消融肿瘤,对照组不予处理。通过术前术后神经运动功能的变化评估IRE消融的安全性。术后每3日超声监测肿瘤及血管,绘制肿瘤生长曲线,术后1天、4天、7天、14天超声引导下用20G活检针采取观察组荷瘤兔术区肿瘤组织,通过组织病理学检查,包括脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记（TUNEL）染色、CD45+染色、CD4+染色、CD8+染色、CD4+CD25+染色,评价IRE的有效性、免疫效应及生物效应机理机制。解剖组选取11只荷瘤兔,术前解剖1只作为空白对照,剩余荷瘤兔于左侧腹股沟股骨旁近神经血管处消融肿瘤,术后超声监测术区血管,并分别于术后1天、7天、14天、21天及28天解剖2只兔子,分离血管、神经及肌肉,予以固定包埋,行苏木精-伊红（H＆E）染色、马松三色（Masson）染色、Luxol Fast Blue（LFB）染色、S-100蛋白免疫组化染色,比较两组的病理情况,进一步评估IRE消融的安全性。第二部分:IRE在不同针距和不同脉冲发射方式下引起的消融效应研究。选取13只空白兔子,分为两组,第一组距离组8只空白兔探究手术方案,于腹股沟神经血管处,按照两针尖距离神经血管的距离再次分为:D1组（针尖连线垂直于神经,神经位于两针尖中点）、D2组（针尖位于神经一侧,两针连线平行于神经,距神经0mm）、D3组（针尖位于神经一侧,两针连线平行于神经,距神经10mm）、D4组（针尖位于神经一侧,两针连线平行于神经,距神经5mm）,按实验一发射脉冲,四组予以相同参数的刺激,术后观察各组双侧肢体的的运动功能,术后7天予以解剖神经、血管及肌肉,行HE染色,Masson染色,LFB染色,S-100蛋白免疫组化染色评价对神经、血管及肌肉的影响。第二组探究不同脉冲发射方式引起的消融效应。5只兔子,左后肢为脉冲1组,右后肢为脉冲2组,脉冲组按D4组方式布针,左后肢予以1号（+）消融针发射200脉冲,右后肢予以1号（+）、2号（-）消融针分别发射100个脉冲,其余参数相同。术后一周于左后肢解剖1号电及2号电消融针处附近组织,右后肢予以解剖2号电极消融针处附近组织,并予以固定包埋,行HE染色,Masson染色,LFB染色,S-100蛋白免疫组化染色评价对神经、血管及肌肉的影响。结果:第一部分:组织包埋法成功率100%,荷瘤兔存活率97.5%。在IRE消融有效性及局部免疫的研究中,消融后1天肿瘤呈水肿状态,术后7天逐渐坏死,术后10-14天消融坏死区域体积固定,不再增大。消融后1-4天细胞呈持续凋亡状态。术后对照组肿瘤体积呈倍数增长,术后10天后肿瘤中心开始逐渐死亡,IRE组术后也因消融区域逐渐坏死,而测量体积也逐渐增大,在不考虑肿瘤活性的情况下,术后4、7、10、13天两组间仍有明显统计学差异。在局部免疫研究中发现术后1天CD45+浸润细胞显著升高,术后1周后下降;CD8+T细胞术后1周内较对照组显著提高,术后4天、7天具有统计学差异;CD4+T细胞也在术后4天内显著升高,较对照组具有统计学差异,术后7天下降;Treg细胞百分比在术后1周内逐渐升高,与上述指标趋势相反,术后2周下降,且较对照组具有统计学差异。在IRE消融安全性研究中,消融中及消融后未出现严重并发症,观察组中两组术后体重下降,但无统计学差异。术后1天IRE组荷瘤兔运动功能下降,后运动功能逐渐恢复,术后1、4、7、10天两组间具有显著的统计学差异,术后13天两组间无统计学差异,术后16天IRE组荷瘤兔运动功能继续改善。神经的病理检查发现术后1天轴突、髓鞘未见异常,未见明显纤维组织增生,部分施万细胞空泡化;术后1周明显可见半数（1/2）轴突肿胀,偶可见轴突碎裂,并可见椭圆体包含肿胀轴突及碎裂的髓鞘,除此以外还可见神经束内较少的施万细胞及神经纤维间纤维组织增生。术后2-4周后轴突肿胀数目逐渐下降,轴突逐渐恢复原来形态,椭圆体减少,术后2-3周神经束内纤维组织进一步增加,术后4周纤维组织未见增加;术后4周大部分髓鞘逐渐恢复术前形态,未见明显施万细胞增生。在血管病理中术后1天仍可见血管3层结构,内膜存在,内膜细胞核大部分丧失原来形态,不再沿内膜走形分布,中膜内细胞核半数固缩,染色加深,血管整体形状无变化,呈类圆形;术后1周血管内膜/外膜面积比明显下降,可见部分内膜波浪形状部分消失,无法辨别内膜层,部分方向上内膜内侧可见纤维组织增生,内填充炎症细胞,中膜内肌细胞形态分界不清,部分方向上平滑肌细胞较少,纤维结缔组织增多,血管壁各方向厚薄不均;术后2周血管内膜波浪型状模糊,中膜/外膜比增加,纤维结缔组织进一步增多,血管壁各方向厚薄较前均匀,外膜纤维组织增多;术后3周血管内膜细胞核仍未恢复正常形态,中膜进一步增厚;术后4周血管内膜、中膜、外膜对比术后3周血管无明显变化。在超声检查中,术后4天超声仍可见肿瘤内小血管影,股浅动脉内未见血栓动脉壁正常;术后7天、术后10天超声下则未见小血管影,股浅动脉仍正常。术后可见肌纤维明显破坏,肌纤维束间距的增宽,随后细胞浸润,纤维结缔组织增加和肌纤维增粗增多,并逐渐恢复。第二部分:在IRE手术方案的研究中可发现,术后4天距离组D2组的运动功能与其余3组间具有统计学差异;术后7天可见所有组别的兔子的神经运动功能都呈恢复状态,而D1组及D2组与D3组间仍具有统计学差异。神经病理可见D2组神经受损程度明显高于D1、D3和D4组,D3组神经受损最低,D2组神经损伤最严重。血管病理中D2组术后中膜平滑肌细胞面积百分比最低,D2组与D3、D4组间有统计学差异（p＜0.05）,D3组与D4组间比较也具有统计学差异（p＜0.05）。在探究不同脉冲发射方式引起的消融效应可发现,脉冲1组和脉冲2组术后运动功能无明显差异。脉冲1组a处较b处及脉冲2组损伤稍大,但新生施万细胞较多。脉冲1组a处、脉冲1组b处及脉冲2组间中膜细胞百分比无明显统计学差异。肌肉病理中脉冲1组a、b两处肌肉面积占比无明显统计学差异。结论:本课题成功建立了适用于IRE的动物模型,以此为基础进行了 IRE消融骨转移瘤,验证了在血管神经旁手术的安全性和有效性。确定治疗参数和电极排布方式。对IRE过程中一些免疫激活、温度变化和肌肉抽搐的电生理现象进行探究,本课题发现了以下规律,为IRE消融骨转移瘤的临床应用提供实验和理论依据。1、VX2肿瘤组织包埋法成瘤率高,生长迅速,可用于转移瘤局部治疗研究。2、IRE消融可以有效控制肿瘤生长,消融术后促使细胞持续凋亡,有效性好。3、IRE消融术后1周内抗肿瘤免疫反应增强。4、对骨转移瘤的治疗效果取决于所输出能量对于治疗区域不同组织细胞的致死效果,电场强度取决于输出电压和电极间距,与输出电压成正比,与电极间距成反比;对治疗效果的评价,需要综合上述各项因素,分别对不同治疗参数下相应目标组织的细胞致死情况进行实验,以确认有效性和安全性的界限。IRE消融术后对血管、神经无致死性损伤,基本结构仍存在,术后1周后逐渐恢复,功能存在,且逐渐恢复正常,安全性高。5、布针方式不同导致作用组织效果的差异,距离消融针越近,损伤越大。发射相同数量的脉冲时,双方向发射较单方向发射损伤组织更小,更均匀。