研究背景及目的变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)是引起人类龋齿的主要致龋菌之一,它的高致龋能力与其产酸、耐酸、黏附等特性密切相关。2002年,S. mutans UA159全基因组测序工作完成,研究表明,该菌中与碳水化合物代谢相关的基因占了15%,与现有其它已测序的革兰氏阳性菌基因组对比,S. mutans呈现出更强的碳水化合物代谢能力。S. mutans转运吸收碳水化合物主要是通过磷酸烯醇式丙酮酸：磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate-dependent:phosphotransferase system, PTS)完成的。目前在S. mutans UA59中已发现超过14种PTS,包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甘露糖等。PTS一般由酶Ⅰ、HPr和酶Ⅱ复合体三部分组成。其中酶Ⅰ、HPr不具有糖特异性,负责将磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)转移至酶Ⅱ复合体。酶Ⅱ复合体则具有糖特异性,负责对特定底物的跨膜转运及磷酸化,一般由三个蛋白组成：ⅡA、ⅡB和ⅡC。虽然S. mutans可以通过ABC转运体或其他方式吸收利用碳水化合物,但最主要的方式依然是通过PTS,因此研究S. mutans PTS中相关蛋白对理解该菌的致龋作用有重要意义。研究报道,某些肠道细菌,如大肠杆菌(Escherichia Coli, E.coli)、乳酸杆菌(Lactobacillus)等在无氧条件下能通过发酵抗坏血酸来获得维持生命活动的碳源,但目前未见关于S. mutans对抗坏血酸吸收利用的报道。2009年,雷剑推测PtxA蛋白(由ptxA基因编码)可能与S. mutans抗坏血酸代谢过程相关,对应PTS中的EⅡA,对该蛋白的三维晶体结构解析和体外酶活实验也证明PtxA蛋白对抗坏血酸磷酸化具有特异性。因此,在S. mutans内存在能吸收并磷酸化抗坏血酸的PtxA蛋白可能对该菌能在接近无氧的口腔环境中旺盛生长具有关键性作用。因此本研究拟针对PtxA蛋白,通过构建ptxA基因突变菌株,对其生长活性、产酸能力、耐酸能力、生物膜形成能力等致龋性进行研究,探讨其致龋机制,为防龋研究开辟新思路。第一章 变异链球菌ptxA基因突变菌株的构建目的：构建S. mutans UA159 ptxA基因突变菌株,为下一步的实验提供基础。方法：根据NCBI提供的S. mutans UA159全基因组序列,采用Primer Premier 5.0软件设计ptxA基因的上下游引物,通过PCR方式扩增上下游片段,然后通过双酶切、连接、转化、筛选鉴定等方法构建含有ptxA基因上游片段的重组质粒pFW5-ptxA-up,接着在此重组质粒基础上,再用相同的方法构建含有ptxA基因下游片段的重组质粒pFW5-ptxA-up-down,最后将该重组质粒转化入S. mutans感受态细胞中,利用同源重组原理构建ptxA基因突变菌株,命名为SM-ptxA-def。结果：1、重组质粒pFW5-ptxA-up经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,电泳结果出现2条带,与质粒pFW5和ptxA-up片段的大小基本相同,重组质粒测序结果显示99%相符。2、重组质粒pFW5-ptxA-up-down经过NcoⅠ和Nde Ⅰ双酶切后,电泳结果出现2条带,与质粒pFW5-ptxA-up和ptxA-down片段的大小基本相同,重组质粒测序结果显示99%相符。3、使用相同的ptxA-up-F和ptxA-down-R引物进行扩增,电泳结果显示SM-ptxA-def菌株的扩增片段大小与重组质粒pFW5-ptxA-up-down一致,比野生型片段大,与预计相符。SM-ptxA-def菌株的扩增片段测序结果显示100%相符。第二章野生型变异链球菌在抗坏血酸特异性培养基中生长情况目的：探究适合野生型S. mutans UA159在抗坏血酸特异性培养基中生长的最适浓度,并进一步验证ptxA基因与抗坏血酸的吸收利用有关,为研究SM-ptxA-def菌株生物学特性奠定基础。方法：1、最适抗坏血酸浓度探究。将S. mutans UA159在BHI培养基中厌氧培养24h后,用TV培养基(含有3.5%胰蛋白胨、0.04μg/mL对氨基苯甲酸,0.2μg/mL盐酸硫胺酸,1μg/mL烟酰胺和0.2μg/mL核黄素)洗涤,调节OD600=1.0左右,按1：100比例加入到含有5mM、10mM、15mM、20mM、30 mM抗坏血酸浓度的TV培养基中,37℃厌氧培养48h,每2h取2mL菌液测量OD600值。重复实验三次,取均值,绘制细菌生长曲线。2、S. mutans UA159在两种不同碳源培养基中生长情况。将S. mutans UA159在BHI培养基中厌氧培养24h后,用TV培养基洗涤,调节OD600=1.0左右,按1：100比例分别加入到含有15mM抗坏血酸和葡萄糖的TV培养基中,37℃厌氧培养48h,每2h取2mL菌液测量OD600值。重复实验三次,取均值,绘制细菌生长曲线。3、qRT-PCR检测ptxA基因在两种不同碳源特异性培养基中的表达。将S. mutansUA159在15mM抗坏血酸和葡萄糖的TV培养基中培养至对数生长后期,提取总RNA,逆转录合成cDNA,以16S rRNA为内参,进行qRT-PCR反应,检测ptxA基因在两种不同碳源特异性培养基中的表达。4、统计学分析：采用SPSS13.0软件对qRT-PCR结果进行两独立样本t检验,检验水准α=0.05。结果：1、在测量的48h内,菌液的OD600值随时间的增加而增加,表明细菌不断生长。在5mM和10mM时,细菌的停滞期(约为6h)和在对数生长期的生长速度类似,但10mM的终末细菌产量高于5mM。在15mM时,停滞期延长(约为12h),但终末细菌产量比10mM高。在20mM和30mM时,细菌生长速度非常缓慢,终末细菌产量大大低于15mM,30mM时未观察到明显增长。2、S. mutans UA159在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中生长迅速,停滞期短,生长速度快,约14-16h即达到稳定期,终末菌量OD600达到1.0左右。而在以抗坏血酸为唯一碳源的培养基中则生长缓慢,停滞期延长,生长速度也较慢,约36h才达到稳定期,终末菌量OD600仅为0.6左右。3、ptxA基因在以抗坏血酸为唯一碳源培养基中的表达量明显高于在以葡萄糖为唯一碳源培养基的表达量,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、S. mutans UA159在15mM抗坏血酸培养基中生长最佳,因此确定其为后续实验的实验浓度。2、ptxA基因与S. mutans UA159在抗坏血酸特异性培养基中生长相关。第三章SM-ptxA-def菌株生物学特性的初步研究目的：研究ptxA基因突变后对S. mutans UA159的生长活性、产酸能力、耐酸能力、生物膜形成能力等生物学特性的影响。方法：1、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株生长活性比较。将两种细菌在BHI培养基中厌氧培养24h后,调节菌液OD600约为相等,然后按1：20比例加入到含有15 mM抗坏血酸的TV培养基中,混匀后置于37℃厌氧系统中培养48h,每2h取2mL菌液测量OD600值。重复实验三次。2、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株产酸能力比较。将两种细菌在BHI培养基中厌氧培养24h后,调节菌液OD600约为相等,然后按1：20比例均加入含有15 mM抗坏血酸的TV培养基中,混匀后置于37℃厌氧系统中培养48h,测量培养前后菌液pH值,得到两种菌株培养前后的△pH。重复实验三次。3、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株耐酸能力比较。将两种细菌在BHI培养基中厌氧培养24h后,调节菌液OD600约为相等,然后按1：20比例加入到含有15 mM抗坏血酸的TV培养基中,混匀后置于37℃厌氧系统中培养OD600≈0.3,取1mL菌液,用pH 7.0的甘氨酸溶液洗涤2次,重悬,再将其置入pH 2.8的甘氨酸溶液中0,15,30,45min,稀释,涂板,厌氧培养48h后计算菌落总数,细菌活力以生存率(N/N0)表示：处理后菌落数(N)/处理前菌落数(No)。重复实验三次。4、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株生物膜形成能力比较。将两种细菌在BHI培养基中厌氧培养24h后,调节菌液OD600约为相等,然后按1：20比例均加入到含有15mM抗坏血酸的TV培养基中,混匀后置于37℃C厌氧系统中培养至菌液混浊,调整OD600=1,按1：40比例接种到96孔酶标板中,每组各设置3个复孔,每孔150μL,厌氧培养24h后使用多功能酶标仪测量OD595,丢弃悬浮菌液,灭菌水漂洗1次,沥干,加入30μL0.1%结晶紫溶液染色15min,弃去染色液,灭菌水漂洗3次,室温干燥后,加入4：1的乙醇：丙酮混合液,使用多功能酶标仪测量OD570,计算生物膜量比值：OD570/OD595。5、统计学分析：采用SPSS13.0软件对实验结果进行统计,检验水准α=0.05。野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株的产酸、耐酸和生物膜形成能力均采用两独立样本t检验进行统计学分析。结果：1、与野生型相比,SM-ptxA-def菌株的停滞期更长,生长速度略慢,终末菌量更低。2、在抗坏血酸特异性培养基中培养48后,野生型S. mutans UA159的培养基中△pH值明显高于SM-ptxA-def菌株(P<0.05)。3、在抗坏血酸特异性培养基中培养的野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株在pH2.8的甘氨酸缓冲液中孵育长达45min后,死亡速率类似,无明显统计学差异(P>0.05)。4、在抗坏血酸特异性培养基中,野生型S. mutansUA159的生物膜形成量显著高于SM-ptxA-def菌株,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、ptxA基因缺失对S. mutans在抗坏血酸特异性培养基中的生长有一定影响。2、ptxA基因可能与S. mutans在抗坏血酸特异性培养基中的产酸能力有关。3、ptxA基因与细菌的耐酸能力无明显关系。4、ptxA基因可能与S. mutans在抗坏血酸特异性培养基中的生物膜形成有关。