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研究背景:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的主要原因之一。由于缺乏有效的治疗手段,在恶性肿瘤中,肺癌的致死率最高。因此,深入探索肺癌的发病机制以及寻求新的治疗靶点显得尤其重要。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是花生四烯酸经过环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)催化后的主要代谢产物。PGE2通过与细胞膜上的四种EP受体(EP1受体、EP2受体、EP3受体、EP4受体)结合,促发胞内信号转导,调控靶基因转录与蛋白表达,从而促进多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。整合素家族成员β1-integrin蛋白是一种重要的粘附分子,主要介导细胞与细胞之间、细胞与胞外基质之间的相互作用,参与调节细胞的生长、分化、迁移和侵袭等多种生物学行为。已有研究表明:在肺癌中,β1-integrin蛋白可以通过调节纤连蛋白来刺激肿瘤细胞增殖,并且这一过程与COX-2的表达与PGE2的合成有关,然而其中确切的机制尚未明确。本课题以此为背景,研究在非小细胞肺癌中,PGE2对β1-integrin蛋白表达水平的调控作用以及主要的信号转导通路。研究目的:探讨在非小细胞肺癌细胞中,PGE2对β1-integrin蛋白表达水平的影响以及其主要的信号转导通路。研究方法:1、细胞培养:常规方法培养人非小细胞肺癌a549细胞。2、采用浓度梯度剂量的外源性pge2处理a549细胞,以westernblot实验检测β1-integrin蛋白表达水平的变化。3、分别用ep1受体激动剂17-pt-pge2、ep2受体激动剂butaprost、ep3受体激动剂sulprostone和ep4受体激动剂alcohol处理a549细胞,以westernblot实验检测各型ep受体激活对β1-integrin蛋白表达水平的影响。4、分别用ep1受体抑制剂sc51322、ep2受体抑制剂ah6809、ep3受体抑制剂l798106和ep4受体抑制剂ah23848处理a549细胞,再给予pge2处理,以westernblot实验检测阻断不同ep受体对β1-integrin蛋白表达水平的影响。5、采用浓度梯度剂量的17-pt-pge2处理a549细胞,以westernblot实验检测β1-integrin蛋白表达水平的变化。6、以sirna实验干扰a549细胞ep1受体的表达后,给予pge2处理,以westernblot实验检测β1-integrin蛋白表达水平的变化。7、收集非小细胞肺癌组织标本34例和正常肺组织标本10例,以免疫组化实验检测肺癌组织和正常肺组织中ep1受体与β1-integrin蛋白的表达情况。8、分别用17-pt-pge2、17-pt-pge2+itgβ1mab处理a549细胞,transwell实验检测细胞迁移能力的变化。9、采用17-pt-pge2处理a549细胞0、15、30、60、120min后,以westernblot实验检测p-ikba和p-p65蛋白表达水平的变化。10、采用nf-kb抑制剂pdtc处理a549细胞,以westernblot实验检测β1-integrin蛋白表达水平的变化。研究结果:1、用0-5μmol/l浓度梯度剂量的pge2处理a549细胞24h,westernblot实验结果显示:实验组β1-integrin蛋白表达水平较对照组明显升高,并呈现浓度梯度依赖性。当pge2浓度分别为1、3、5μmol/l时,β1-integrin蛋白表达水平较对照组分别上升了16.23%、62.83%、88.12%。2、用5μmol/lep1受体激动剂17-pt-pge2处理a549细胞24h,westernblot实验结果显示:β1-integrin蛋白表达水平较对照组上升了110.85%。3、用10μmol/lep1受体抑制剂sc51322预处理a549细胞1h,再加入5μmol/lpge2处理24h,westernblot实验结果显示:β1-integrin蛋白表达水平较单纯pge2处理组下降了53.63%。4、用0-10μmol/l浓度梯度剂量的17-pt-pge2处理a549细胞24h,westernblot实验结果显示:实验组β1-integrin蛋白表达水平较对照组明显升高,并呈现浓度梯度依赖性。当17-pt-pge2浓度分别为1、2.5、5、10μmol/l时,β1-integrin蛋白的表达水平分别较对照组分别上升了56.69%、172.96%、290.48%、106.68%。5、用特异序列的sirna实验下调ep1受体表达水平,再加入5μmol/lpge2处理a549细胞24h,westernblot实验结果显示:ep1rsirna组较n.csirna组β1-integrin蛋白表达水平无差异,但ep1rsirna+pge2处理组较n.csirna+pge2处理组β1-integrin蛋白表达水平下降了85.83%。6、免疫组化实验显示:3/4以上的非小细胞肺癌组织中ep1受体和β1-integrin蛋白表达水平显著高于正常肺组织,并且ep1受体和β1-integrin蛋白具有明显的共表达现象。7、用3μg/mlβ1-integrin单克隆抗体处理a549细胞30min,再加入5μmol/l17-pt-pge2处理24h,transwell实验结果显示:itgβ1mab+17-pt-pge2处理组较单纯17-pt-pge2处理组,细胞的迁移率下降了23.6%。8、用5μmol/l17-pt-pge2处理a549细胞0-120min,westernblot实验结果显示:在第30min时,实验组p-ikba较对照组上升了23.80%,在第30、60、120min时,实验组p-P65分别较对照组上升了98.28%、131.25%、115.11%。9、用5μmol/L PDTC预处理A549细胞1h,再加入5μmol/L 17-PT-PGE2处理24h,Western Blot实验结果显示:PDTC+17-PT-PGE2组较17-PT-PGE2组,β1-integrin的水平下降了59.62%。研究结论:本研究结果表明,PGE2可通过激活EP1受体并经NF-kB信号转导通路明显上调A549细胞中β1-integrin蛋白的表达并促进肿瘤细胞迁移。