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阿片类药物是临床最常用、最有效的镇痛药物,但在应用中可伴随严重的副作用。椎管内给药具有用量小、不良反应发生率低、镇痛作用持久的优点,却易引发阿片耐受。目前,寻找可强化阿片类药物镇痛作用,减少其用量及降低不良反应的新型辅助药物已经成为研究的热点。胍丁胺(agmatine,AG)是咪唑啉受体(imidazoline receptor,IR)的内源性配体,广泛存在于中枢神经系统内,作用于咪唑啉受体和α2肾上腺素受体,并可能在受体后与阿片、NMDA受体间相互作用,被认为是一种新的神经递质和/或神经调质。研究表明胍丁胺可以显著提高阿片类药物的镇痛作用,还能有效地预防和治疗吗啡的耐受和依赖;还可能通过作用于咪唑啉受体参与某些神经递质(如儿茶酚胺)和激素的释放,产生降低血糖和利尿等多种生物学效应;从而拮抗疼痛所引起的高血压、高血糖等应激反应。目前椎管内应用胍丁胺强化阿片类药物镇痛,减轻吗啡耐受和依赖尚缺乏系统性的研究。因此,本课题拟通过在体和离体两部分实验探讨胍丁胺作为椎管内阿片类药物辅助药的可行性:实验一观察胍丁胺对原代培养脊髓神经元的毒性作用及对谷氨酸(glutamate,Glu)损伤后神经元的影响。采用原代细胞培养法,分离培养胚胎大鼠脊髓神经元,3d后加入不同浓度的AG(0.5～80μg/ml)继续培养12h、24 h和36h,接着采用四甲基氮唑蓝法和中性红法分别测定胍丁胺对细胞存活率以及毒性的影响。另外在加入AG的同时给予2mmol/L Glu对细胞进行损伤,建立体外神经元损伤模型,然后进行细胞形态学观察、β-tubulinⅢ免疫细胞化学染色、四甲基氮唑蓝法测定细胞存活率、Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡和坏死率,同时检测神经元中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化。结果发现,AG浓度低于40μg/ml时对正常培养脊髓神经元的存活没有影响,当AG达到80μg/ml后,神经元生长受到一定影响;给予Glu损伤后,神经元细胞生长状态较差,出现退化,而且细胞存活率显著下降,坏死和凋亡率显著增高(P<0.05或0.01),给予AG干预(AG-Glu组)细胞生长显著优于Glu组,且细胞凋亡和坏死率降低,细胞存活率增高,MDA含量减少(P<0.05)。提示AG作为一种新型神经递质或调质,在对正常生理情况下神经元的生长没有毒副作用,而在Glu诱导损伤条件下,能抑制Glu诱导的损伤;其发生机制可能与AG通过拮抗N-甲基-M-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体,阻断或抑制Glu的氧化毒性的级链反应有关。实验二观察脊髓水平给予胍丁胺对鞘内吗啡镇痛作用的影响。30只SD大鼠随机分为3组,每组10只。C1组:鞘内注射生理盐水10μl;M1组:鞘内注射吗啡(15μg/10μl);AM1组:鞘内同时给予吗啡15μg+胍丁胺12.5μg/10μl。所有大鼠均于鞘内给药后5min于跖部皮下注射蜜蜂毒50ul (0.2mg)致痛,观察并纪录1h内大鼠的自发缩足反射次数。结果发现:与C1组比较,M1组(吗啡组)1h内大鼠的自发缩足反射次数显著减少,提示鞘内注射吗啡对蜜蜂毒诱致的自发痛具有显著性抑制作用(P<0.05);鞘内同时给予吗啡和胍丁胺(AM1组),大鼠自发缩足反射次数进一步减少,与M1组比较具有显著性意义(P<0.05),提示鞘内胍丁胺和吗啡联合用药可显著增强吗啡对蜜蜂毒诱致自发痛的抑制作用,具有协同效应。实验三观察胍丁胺对鞘内吗啡耐受的翻转效应。24只SD大鼠随机分为3组,每组8只。C2组:生理盐水对照组;M2组:吗啡耐受组,鞘内注射15μg吗啡5μl+0.9%氯化钠注射液10μl连续4天;AM2组:吗啡耐受+胍丁胺组,鞘内注射15μg吗啡5μl+0.9%氯化钠注射液10μl每天两次,连续3天后,第四天鞘内注射15μg吗啡5μl+12.5μg胍丁胺10μl。所有大鼠均于每次给药后10min后检测大鼠热刺激潜伏期和机械刺激阈值。另取24只SD大鼠分组和前3天处理同上,在第4天鞘内注射药物5 min后,于跖部皮下注射蜜蜂毒50μl(0.2mg)致痛,观察并纪录1h内大鼠的自发缩足反射次数。结果:与对照组比较,鞘内吗啡可显著提高正常大鼠热刺激潜伏期和机械刺激阈值(P<0.05);连续注射吗啡三天后,吗啡(M2组)提高痛阈的效应消失,热刺激潜伏期和机械刺激阈值基本正常,与对照组比较无显著性差异(P﹥0.05),提示吗啡耐受形成;第4天胍丁胺和吗啡联合用药(AM2组)后,吗啡耐受大鼠已降低的热和机械刺激阈值又明显升高,与吗啡组(M2)和第3天给药后比较均有显著性差异(P<0.05);同样,胍丁胺和吗啡联合用药组对蜜蜂毒诱致自发痛的抑制作用也显著强于吗啡耐受组,1h内大鼠自发缩足反射次数明显减少(P<0.05),提示胍丁胺对大鼠基础痛阈和炎性自发痛的吗啡耐受,都具有翻转效应。综上所述,本研究结果表明胍丁胺在正常生理浓度对脊髓神经元存活和生长没有明显的副作用;对谷氨酸诱导的神经元损伤有浓度依赖性抑制作用。鞘内胍丁胺对吗啡抑制蜜蜂毒诱致的自发痛具有协同作用,且可翻转鞘内重复注射吗啡所引起的耐受,作为椎管内阿片类药物的辅助药具有一定的可行性。