微囊藻毒素合成酶基因PCR检测方法的建立及应用

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微囊藻水华在世界范围内频繁发生,可产生损害人类健康的微囊藻毒素,是淡水水体中危害性最大的水华之一。微囊藻毒素主要由微囊藻产生,是一种细胞内毒素,具有强的促癌作用,长期饮用含微囊藻毒素的水能造成人和动物的中毒及肝损伤。常用的HPLC、ELISA等方法能检测存在于水体中的微囊藻毒素,但无法在毒素从藻细胞内释放之前,对微囊藻的产毒能力进行判断。 本文针对微囊藻毒素合成酶基因——mcyB,设计、筛选特异性引物,建立了适用于微囊藻毒素基因检测的全细胞PCR方法。该方法不受藻细胞的生长时期影响,也不受其它藻类细胞或杂菌的干扰。灵敏度测试结果表明,取10 μL藻细胞样品为模板,在50 μL反应体系中,一步PCR检测下限为100-1000cells/反应,二步PCR(即套式PCR)检测下限为1-10 cells/反应。套式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点,可用于低藻浓度水样的微囊藻毒素基因检测。 以上述方法对从广东省11个供水水库中分离的30株微囊藻进行毒素基因检测。这11个水库分别是鹤地水库、汤溪水库、流溪河水库、大镜山水库、沙田水库、高州水库、契爷石水库、飞来峡水库、深圳水库、新丰江水库和赤石迳水库;30株微囊藻分属于水华微囊藻、铜绿微囊藻和具缘微囊藻。共检测出微囊藻毒素基因阳性藻株12株,阳性率为40%,其中8株为水华微囊藻。阳性藻株分别来自鹤地水库、汤溪水库、流溪河水库、大镜山水库、高州水库、飞来峡水库和深圳水库等7个水库。 对广东省12个供水水库的水样进行微囊藻毒素基因PCR检测。12个水库包括前述11个水库以及大沙河水库,共136个水样,采集时间从2003年6月至2004年4月。检测发现,水样经一步PCR扩增,检出阳性样品15个,阳性率为11.1%;二步PCR检出阳性样品59个,阳性率为43.4%。除深圳水库外的11个被检水库均出现阳性样品。其中汤溪水库、高州水库、大镜山水库和沙田水库套式PCR检测阳性率分别为95.2%、66.7%、66.7%和60.0%,表明具产毒潜力的微囊藻在这四个水库中普遍存在,建议将这四个水库作为重点监测对象。值得注意是的,汤溪水库一步PCR检测阳性率已达47.6%,根据一步PCR灵敏度推算,阳性样品中具产毒潜力的微囊藻密度在1×10~5cells/L以上,应引起有关方面的重视。
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