严重急性呼吸道综合症即为人们所熟知的SARS(SevereAcuteRespiratorySyndrome)，是2002年11月在我国南方首次发现的一种新型的呼吸道传染病，短短几个月内传播到世界多个地区。由于其传染性强，发病快，病症重，病死率高，不易控制，对人民群众的生命财产和经济利益造成了巨大的损失。2003年4月，在世界卫生组织及多国科学家的共同努力下，SARS的病原体被确诊为一种新型的冠状病毒。 虽然SARS病情已于2003年7月得到了基本控制，但这种疾病的病因、病原体的来源、治疗该病的药物、用于预防的疫苗等都未得到很好的解决。如何更好地认识SARS、攻克SARS成为科学家们急需解决的问题。研究SARS病毒(SARS-CoV)的主要结构蛋白对于认清其致病机理、寻找其治疗和预防药物具有重要的意义。该课题采用基因工程的方法，利用真核表达系统来研究SARS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)的表达，以便为开展N蛋白的相关研究打下基础。 由SARS-CoV的RNA反转录出cDNA。利用巢式PCR以cDNA为模板，特异扩增出N蛋白基因。经1％的琼脂糖凝胶分离后，切胶回收N蛋白基因，连接至pMD18-T载体后测序。序列输入GenBank进行比对，确定为SARS-CoV的N蛋白基因，获得含有目的基因的重组载体pMD18-T-N。 设计包含Kozak序列的引物，从重组载体pMD18-T-N上扩增N蛋白基因，电泳分离、切胶回收后与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行A-T克隆。连接产物转化TOP10感受态细菌，含氨苄青霉素的LB平板进行筛选。生长出的单克隆经菌落PCR初步鉴定为阳性克隆后，扩大培养，提取重组载体测序鉴定。测序结果进行序列比对，确定构建正确的裂殖酵母重组真核表达载体pNMT1-TOPO-N 经测序鉴定的阳性TOP10克隆扩大培养，提取重组表达载体。纯化后，经电击仪电转化裂殖酵母TCP1。用含硫胺素的亮氨酸营养缺陷性基本培养基(EMM+T)进行筛选，生长出的单克隆进行菌落PCR鉴定。在EMM+T液体培养基中接种阳性重组酵母克隆，30℃摇床振摇培养过夜。收集菌体，用蒸馏水及EMM进行洗涤除去硫胺素残余物后，接种一小份至EMM表达培养基中诱导表达。30℃摇床振摇培养18小时，离心收集菌体，破壁后收集上清。 上清中的N蛋白先用SDS-PAGE电泳进行大小鉴定。在10％的分离胶中得到一条大约47kD的蛋白条带。然后转印至硝酸纤维素膜(NC)上，进行Western-blot分析，同样得到一条特异的大小约为47kD的条带。表明已利用重组表达载体在裂殖酵母中成功地表达出了N蛋白。 由于真核表达系统能对表达后的蛋白进行修饰，使蛋白具有天然的构象与活性，所以表达出的N蛋白可以用于研究其蛋白构象，其在病毒致病机理中的作用，还可以用于SARS诊断与药物开发的研究中。