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皮肤的老化是人体衰老最突出的表现之一,减缓皮肤的衰老一直是人们追求的目标。其中真皮成纤维细胞是皮肤中主要功能细胞之一,也是皮肤抗衰老的主要目标细胞。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)存在于成熟脂肪组织中,其含量丰富,提取简便,供区易被患者接受,被认为是有极大应用前景的干细胞。多个研究证实脂肪干细胞据报道可旁分泌多种细胞因子,包括炎症因子、血管源性因子、生长因子等等。这些细胞因子构成了ASCs生长的微环境,通过多种途径对周围组织和细胞产生作用和影响。ASCs本身的分化数量相对较少,它们更像组织细胞活动的组织者,而不是参与者。有许多研究表明ASCs生物活性的生长因子可与周围组织和细胞进行信号传导,并表现出对伤口愈合,组织修复和抗衰老的积极作用。但ASCs微环境对成纤维细胞的长时间作用尚未见报道。ASCs微环境是否会改变成纤维细胞的衰老状态,通过何种机制改变,这些问题都尚不清楚。细胞的衰老本身也是细胞的一种自我保护机制,防止细胞在外界刺激下过度增殖甚至形成肿瘤。其中p53/p21通路是调节细胞周期、导致细胞衰老、防止肿瘤发生的重要信号通路。本课题将用人脂肪干细胞及人真皮成纤维细胞进行非接触性间接共培养,进一步研究脂肪干细胞微环境对真皮成纤维细胞的作用,并通过测定成纤维细胞衰老相关性beta-半乳糖苷酶研究成纤维细胞衰老状态的改变,另外还通过p53、p21蛋白的表达,研究ASCs微环境对细胞复制及应激衰老相关的p53/p21信号通路的变化。一、人脂肪干细胞分离、培养、鉴定及与成纤维细胞共培养体系的建立目的:为研究人ASCs微环境与对真皮成纤维细胞的作用,需分离培养ASCs与成纤维细胞,并用Transwell小室构建细胞间接共培养体系。方法:(1)各取5例青年人(年龄<30岁)及老年人(年龄>60岁)整块腹部皮下脂肪组织(约5g)做CD44免疫组织化学染色,每张切片选择4个视野做阳性细胞计数并观察CD44细胞分布。(2)用负压针管抽吸或切除的脂肪组织分离培养ASCs,并用流式细胞仪对CD34、CD44、CD90做细胞鉴定。(3)分离培养人真皮成纤维细胞,并用Transwell小室与ASCs构建间接细胞共培养体系。结果:(1)脂肪组织的免疫组化染色发现CD44+细胞主要位于纤维结缔组织中,与血管内皮细胞紧密联系。(2)用脂肪组织培养的原代ASCs的表面抗原表达为CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。(3)用Transwell小室成功建立ASCs与成纤维细胞间接共培养体系。结论:CD44+细胞主要位于脂肪的纤维结缔组织中,用注射器抽取的游离脂肪组织可以增加胶原酶消化效率,得到足够的原代ASCs,其抗原表达为CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。用Transwell小室可以构建ASCs与成纤维细胞间接共培养体系。二、脂肪干细胞微环境对真皮成纤维细胞功能的影响目的:研究脂肪干细胞旁分泌因子所构成的微环境对不同年龄人成纤维细胞功能的影响。方法:本实验将成纤维细胞分成4个组,分别在培养后24h、48h、72h用细胞增殖比色法MTT(四唑盐)法检测各组成纤维细胞增殖情况;用实时定量(real-time)PCR检测I型胶原,基质金属蛋白酶-1(MMP-1)m RNA在成纤维细胞中的表达。结果:共培养组的青年和老年HDFs的细胞增殖均显著高于相应对照组(P<0.01)。共培养老年HDFs的MMP-1 m RNA表达与对照组比较在48h后均显著降低(P<0.01)。其中共培养组MMP-1表达在48h时显著下降(P<0.01),但在72h时下降趋势停止(P>0.05)。在对照组,MMP-1的表达随着时间延长逐渐升高(P<0.05)。在前48 h中,共培养的老年HDFs的I型胶原蛋白的表达呈现逐渐增加,然后在72h略微下降(P>0.05)。共培养青年HDFs的I型胶原表达在也前48h显著升高(P<0.01),并在72h显著下降(P<0.05)。对照组成纤维细胞的I型胶原的表达在24h和48h无显著差异(P>0.05),而青年对照组I型胶原表达在72h出现下降(P<0.05)。结论:本部分实验结果表明脂肪干细胞微环境可促进共培养的成纤维细胞的增殖,同时减少MMP-1的产生,并增加I型胶原的表达。结果表明脂肪干细胞微环境可促进细胞增殖,改善细胞的功能。但这种促进作用随着共培养时间的进一步延长逐渐减小,表明脂肪干细胞微环境可能无法长时间改善成纤维细胞的功能。三、人脂肪干细胞微环境对成纤维细胞衰老状态的改变及对p53/p21通路的影响目的:探索ASCs微环境对成纤维细胞衰老状态的作用及对p53/p21通路的影响方法:分别在培养后24h、48h、72h用real-time PCR法检测各组成纤维细胞衰老相关β-半乳糖苷酶m RNA的变化;用western blot法检测各组成纤维细胞p53、p21蛋白的表达。结果:两个对照组成纤维细胞在第一个24h时在SA-β-Gal的表达无显著差异(P>0.05),培养24小时后各组HDFs中SA-β-Gal的m RNA表达水平的逐渐增加(P<0.05)。老年组HDFs的SA-β-Gal的在每个时间点均表现出更高的表达水平(P<0.01)。两个共培养组中的SA-β-Gal的表达较对照组显着增加更显著(P<0.05)。在各时间点ASCs共培养的成纤维细胞的p53蛋白较对照组的表达均显著升高(P<0.05),p21蛋白表达的检测结果表现出与p53蛋白类似的逐渐升高的趋势(P<0.05),但其升高的幅度要小于p53蛋白。并且在第24h时,共培养组与对照组p21蛋白的表达无显著差异(P>0.05)。结论:与脂肪干细胞微环境下共培养的成纤维细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶m RNA表达会升高,并且随着共培养时间的延长这种作用更加明显,同时p53与p21蛋白也随着培养的时间延长而增加,其中p53蛋白升高得更早、更快,表明脂肪干细胞微环境通过p53/p21通路促进了成纤维细胞的衰老。