基于Wnt/β-catenin通路探讨左归丸对先天肾虚仔鼠免疫功能的影响及其机制研究

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目的
  研究先天肾虚影响免疫功能的理论机制;采用复合应激法,复制仔鼠先天肾虚模型,基于Wnt/β-catenin信号通路,从胸腺角度研究补肾填精代表方之一的左归丸对仔鼠免疫功能的影响及其作用机制。
  方法
  1.理论研究:阐明先天肾虚的病因病机及表现,探讨先天肾虚影响免疫功能的理论机制,探求先天肾虚的治疗方法。
  2.动物实验:3月龄SPF级SD发情期大鼠60只,雌雄SD大鼠按照2∶1的比例每晚合笼制备30只孕鼠,将孕鼠随机分为正常组、模型组、胸腺肽组(0.003g/kg)、左归丸高剂量组(800g/L)和左归丸低剂量组(200g/L),每组6只。正常组不造模给予生理盐水灌胃;模型组造模给予生理盐水灌胃;胸腺肽组造模给予胸腺肽胶囊溶液灌胃;左归丸高剂量组和左归丸低剂量组造模给予左归丸悬浊液灌胃。采用复合应激法刺激孕鼠,直至仔鼠出生。提取新生仔鼠出生当天胸腺和脾脏,计算仔鼠的胸腺指数和脾脏指数,运用流式细胞学技术检测仔鼠胸腺和脾脏内T细胞的分型,运用RT-PCR和WesternBlot技术检测Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白在仔鼠胸腺组织内的表达。用SPSS22.0对所得数据进行统计学分析,结果用均数加减标准差((x)±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。
  3.细胞实验:培养SD仔鼠胸腺上皮细胞(TECs),通过广谱细胞角蛋白(PCK)免疫荧光染色进行细胞类型的鉴定。CCK-8法测定左归丸含药血清和Wnt4抑制剂(ICG-001)对细胞增值率的影响,WesternBlot检测不同ICG-001浓度的抑制效果,两者结合判断左归丸含药血清和ICG-001的最佳实验浓度。将分离培养的TECs分为:对照组、补肾组、Wnt抑制剂对照组、Wnt抑制补肾组。处理24小时后,运用RT-PCR和WesternBlot技术检测Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达,运用Elisa技术检测胸腺素β4(TMSβ4)与胸腺素α1(Tα1)的含量。
  结果
  1.先天肾虚为母代肾虚影响子代而致,先天肾虚正气衰弱,以虚为主,表现出肾相应生理功能的障碍和人体免疫紊乱。
  2.先天肾虚存在人体的阴阳、气血津液、五脏功能的失调,进而影响人体的免疫功能。
  2.动物实验:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺指数和脾脏指数下降(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组仔鼠胸腺指数和脾脏升高(P<0.05)。流式细胞检测显示:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺内SP细胞数上升(P<0.05),模型组仔鼠胸腺内CD4+/CD8+上升(P<0.05),脾脏内CD4+/CD8+下降(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组和左归丸低剂量组胸腺内SP细胞数下降(P<0.05),胸腺内CD4+/CD8+下降(P<0.05),脾脏内CD4+/CD8+上升(P<0.05)。RT-PCR和WesternBlot检测显示:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达减少(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组和左归丸低剂量组胸腺内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达增加(P<0.05)。
  3.细胞实验:PCK免疫荧光染色确定纯化的细胞为TECs。CCK-8检测显示:25μM浓度以下的抑制剂ICG-001和10%,20%的左归丸含药血清不影响细胞增值率,WesternBlot检测显示:25μM浓度以上的抑制剂ICG-001可以抑制TECs内Wnt4的表达。结合两者选取25μM的ICG-001和20%的左归丸含药血清作为实验的药物浓度。Elisa结果显示:与对照组比较,Wnt抑制剂对照组内TMSβ4和Tα1的含量减少(P<0.05),补肾组内TMSβ4和Tα1的含量增加(P<0.05);Wnt抑制对照组比较,Wnt抑制补肾组内TMSβ4和Tα1的含量增加(P<0.05)。RT-PCR和WesternBlot检测结果显示:与对照组比较,Wnt抑制剂对照组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量减少(P<0.05),补肾组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量增加(P<0.05);与抑制剂对照组比较,Wnt抑制剂补肾组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量增加(P<0.05)
  结论
  1.先天肾虚存在机体的阴阳、气血津液、五脏功能异常,进而影响机体的免疫状态。通过母代补肾填精法预防子代先天肾虚,或是治疗先天肾虚的新方法之一。
  2.复合应激法能够成功复制先天肾虚模型。
  3.胸腺内Wnt/β-catenin信号通路表达异常影响T细胞分化发育和迁徙,这可能是先天肾虚仔鼠免疫紊乱的机制之一。
  4.左归丸能够通过激活胸腺内Wnt/β-catenin信号通路,增加Foxn1的表达,促进TECs分泌胸腺肽,调控T细胞分化发育和迁徙,这可能是补肾填精法改善先天肾虚免疫紊乱状态的作用机制之一。
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