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研究背景在全世界,缺血性脑卒中位居死亡疾病第二位,但是针对缺血性脑卒中,目前尚缺乏有效治疗措施。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是被美国食品及药品管理局唯一批准用于救治急性脑卒中的药物,但是较窄的治疗时间窗,继发脑出血、脑水肿等并发症严重限制了 tPA的临床使用,以至于可以从溶栓治疗中获益的脑卒中患者不超过5%。相关研究表明,血脑屏障破坏是引起tPA相关性出血转化及脑水肿的主要原因。因此,寻找一种保护血脑屏障药物,与tPA联合使用,可能会减少tPA引起神经血管并发症风险。目前血脑屏障破坏与tPA引起的并发症之间的具体机制尚不十分明确,有研究指出神经炎症的级联放大参与了这个过程。其中,危险信号分子,例如高迁移率族蛋白 B1(High mobility group-1 protein,HMGB1)和 ATP,可以由缺血受损细胞释放到内环境,引起缺血后小胶质细胞激活和炎症因子表达。HMGB1,作为非组蛋白染色体结合蛋白存在细胞核内,当病原体感染或者组织损伤出现时,HMGB1可由免疫细胞主动分泌或坏死细胞被动释放至胞外,释放到胞外HMGB1可以结合在小胶质细胞表面受体上,启动细胞内信号转导,使炎症因子表达上升,最终导致脑缺血再灌注过程中的强烈炎症反应。此外,HMGB1作为强烈炎症因子,参与了脑缺血再灌注过程中神经元损伤和血脑屏障破坏。相关研究指出,缺血性脑卒中患者,血清HMGB1水平较对照组增加。而在脑缺血动物实验中,抗HMGB1单克隆抗体可减少约90%的梗死体积,降低血脑屏障渗透性。另外,小剂量的 HMGB1 阻断肽(HMGB1-binding heptamer peptide,HBHP)可减轻HMGB1介导的神经元损伤。考虑到神经炎症参与血脑屏障破坏以及tPA相关神经血管并发症,我们提出假说:阻断HMGB1介导的炎症反应可以改善tPA引起的并发症,保护血脑屏障。研究目的1.明确急性脑卒中患者及动物在溶栓治疗前后血清中HMGB1水平的变化;2.探究在动物模型中,阻断HMGB1作用是否可以减轻溶栓引起的并发症;3.探究HBHP的神经保护作用是否与减轻血脑屏障破坏及炎症反应相关。研究方法1.收集急性脑卒中患者及大鼠在溶栓前后的血清,以检测HMGB1的水平;2.采用2h和4.5h脑缺血模型,检测各组大鼠(saline组、tPA组、tPA+scramble组和tPA+HBHP组)的死亡率、神经功能缺损、脑肿胀、脑出血转化情况;3.免疫荧光检测IgG渗漏,Western blot检测occludin蛋白以反映各组大鼠血脑屏障的变化;4.免疫荧光检测小胶质细胞激活,qPCR、Western blot、ELISA检测各组大鼠炎症因子表达。结果1.在患者及大鼠体内,溶栓后血清HMGB1浓度较溶栓前明显增加,但动物实验中,saline组在再灌注4小时后HMGB1浓度较再灌注前并无明显增加。2.在4.5h-MCAO模型中,tPA组死亡率,神经功能缺损、脑肿胀明显加重,tPA联合HBHP治疗可降低死亡率,减轻神经功能缺损、脑肿胀。而2h-MCAO模型各指标各组间的差异无统计学意义。3.在4.5h-MCAO模型,tPA明显增加大脑梗死侧血红蛋白含量,而HBHP改善了出血转化的情况。2h-MCAO模型中,各组之间的差异无统计学意义。4.24小时后,在4.5h-MCAO模型,tPA组梗死侧IgG渗漏及occludin蛋白的破坏较saline组增多,而HBHP减轻了 IgG的渗漏及occludin蛋白的破坏。5.8小时后,免疫荧光结果表明,tPA组的Iba-1细胞数较saline组进一步增加,而HBHP减少了 Iba-1细胞数。qPCR、Western blot和ELISA结果提示 HBHP 减少 IL-1 β、IL-6、IL-12bmRNA 表达,iNOS、COX-2、IL-1 β 蛋白表达,及IL-1β分泌。结论1.tPA溶栓治疗后,短时间内血清HMGB1分泌有所上升。2.HBHP可改善tPA引起的高死亡率、严重神经功能缺损、脑肿胀,脑出血转化风险。3.HBHP的保护作用可能与减轻血脑屏障破坏和炎症反应相关,提示HMGB1可能是引起tPA溶栓后出血转化的风险因子,阻断其作用有助于减少脑卒中溶栓治疗相关并发症。