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精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是指位于睾丸精曲小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化产生精母细胞的一类干细胞。由于SSCs在体外基因修饰、转基因动物生产等方面比胚胎干细胞更具优势,SSCs逐渐成为干细胞研究领域的一个热点。本研究探索了三种不同的饲养层,即睾丸支持细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞对SSCs体外培养的影响以及培养传代后SSCs保持多能性的潜力;应用特异性化学物质定向诱导鸡胚SSCs向成骨细胞、神经元样细胞分化,并对各诱导剂的组合效果及适合浓度进行了比较。以期能为禽类SSCs的研究和利用提供参考资料,为医学研究提供实验素材。研究结果总结如下几点:1.分别以睾丸支持细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞作为饲养层,比较三种不同的饲养层对SSCs体外培养的影响。结果显示:以鸡胚成纤维细胞饲养层培养SSCs可传至四代,每代的AKP阳性克隆率分别为45%、40%、36%和21%。以睾丸支持细胞为饲养层进行培养时传至三代,每代的AKP阳性克隆率分别是40%、32%、和22%。而以鸡肝细胞作为饲养层,SSCs未见有克隆形成,不能进行传代培养,表明鸡胚成纤维细胞适合作为SSCs的饲养层,而鸡胚肝细胞不适合作为SSCs饲养层。2.以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为诱导剂,诱导鸡胚SSCs向成骨细胞分化,比较以上各种诱导剂不同浓度和不同组合形成的诱导液I、II、III、IV,对传代后SSCs的诱导分化效果,钙结节Von Kossa’s法、改良的钙钴法及免疫组化法对成骨细胞进行鉴定,实验结果显示:诱导分化液Ⅱ+Ⅲ的诱导分化效果最好,诱导分化率为85%,与单独使用诱导分化液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的差异显著(p<0.01),但与单独使用诱导液Ⅰ的差异不显著(P>0.05),其诱导效果略好于单独使用诱导液Ⅰ(诱导分化率为83%)。SSCs被诱导15-21天后分化为成骨细胞,诱导后的细胞Von Kossa’s染色可见细胞间布满黑色颗粒,提示有矿化基质沉积;改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色,免疫组化法染色细胞呈阳性。3.以维甲酸(RA)、BHA、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)为诱导剂,诱导SSCs向神经元样细胞分化,比较以上各种诱导剂不同浓度和不同组合形成的诱导液I、II、III、IV,对传代后SSCs的诱导分化效果,甲苯胺蓝染色和免疫组化进行鉴定。结果显示:诱导分化剂Ⅰ(RA)和诱导分化剂Ⅱ(IBMX)的诱导分化效果最好,诱导分化率分别为83%、81%,两者之间无显著差异(P>0.05),但与其他诱导分化剂之间差异极显著(P<0.01)。SSCs被诱导3-7天后分化为神经元样细胞,甲苯胺蓝染色阳性率为78-85%。免疫组化法检测诱导后细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,结果为NSE呈阳性(+)、NF(+)阳性、GFAP呈阴性(-)。