动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是心血管事件发病的共同基础,其病因复杂,而作为其重要组成部分的脂质代谢学说认为,巨噬细胞大量吞噬氧化型低密度脂蛋白形成的泡沫细胞是AS发生的重要起始标志。且已有研究表明,AS斑块的巨噬细胞出现了自噬-溶酶体系统障碍,因此如果可以激活泡沫细胞的自噬-溶酶体系统就有可能使被吞噬的脂质分解,从而治疗AS。岩藻聚糖硫酸酯是一种具有抗炎、降血脂和抗AS等药理活性硫酸多糖。实验室前期研究表明,岩藻聚糖硫酸酯可以通过诱导人宫颈癌细胞Hela细胞和结肠癌HT29细胞发生凋亡以及自噬性程序性细胞死亡。因此,本课题拟以岩藻聚糖硫酸酯处理ox-LDL诱导的泡沫细胞,研究其药理作用,并对其机制进行探究,主要内容如下:1.岩藻聚糖硫酸酯对泡沫细胞的药理活性研究本文通过ox-LDL和巨噬细胞共孵育的方法构建泡沫细胞模型,经油红O染色和胆固醇酯含量测定,结果表明泡沫细胞的最适造模方法为80 μg/mL ox-LDL处理巨噬细胞RAW264.7 24 h。与模型对照组相比,200、400、800 μg/mL岩藻聚糖硫酸酯处理后泡沫细胞的胆固醇酯含量分别下降至43.48%、34.38%、23.17%,且油红O染色也显示脂滴数量明显减少,表明岩藻聚糖硫酸酯可以清除泡沫细胞内的ox-LDL。2.岩藻聚糖硫酸酯对泡沫细胞的药理机制研究泡沫细胞经过岩藻聚糖硫酸酯处理后,通过Western-Blot对自噬相关蛋白、qRT-PCR对自噬相关基因以及Mcherry-GFP-LC3B对自噬通量进行检测。结果显示自噬相关基因LC3Ⅱ等mRNA含量和ATGs蛋白表达量、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和自噬通量均随浓度上升,说明岩藻聚糖硫酸酯可以促进泡沫细胞的自噬。为了进一步探究药理机制,实验将岩藻聚糖硫酸酯和两种自噬抑制剂3-MA、Bafilomycin A1合用,相比上述正常给药组,3-MA处理后胆固醇含量升至57.79%、51.90%和 45.75%,Bafilomycin A1 处理后胆固醇酯含量升至 53.25%、50.57%和45.97%,且油红O染色结果也显示脂滴数量明显增加,表明岩藻聚糖硫酸酯的脂质清除活性大部分被抑制。同时,通过Western-Blot、qRT-PCR和Mcherry-GFP-LC3B对细胞的自噬-溶酶体系统进行检测,LC3 Ⅱ的mRNA和ATGs相关蛋白的表达量变化、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ以及自噬通量的下降说明抑制剂处理后泡沫细胞的自噬被抑制,而TFEB的表达量仍然增加,且具有浓度依赖性。综合以上结果表明岩藻聚糖硫酸酯主要通过促进细胞自噬分解脂质,且可能部分是通过促进TFEB的表达来实现的。3.TFEB和岩藻聚糖硫酸酯药理活性关系的探究实验通过TFEB siRNA对泡沫细胞的TFEB进行沉默。相比上述正常给药组,沉默后泡沫细胞的胆固醇酯含量升至57.78%、50.13%和42.68%,且红色脂滴明显增加。此外,通过Western-Blot对自噬相关蛋白进行检测,结果显示LC3Ⅱ的表达量以及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均明显减少,表明泡沫细胞的自噬被抑制,而ATGs则表现出较弱的浓度依赖性。以上结果说明TFEB在岩藻聚糖硫酸酯促进细胞自噬的通路中十分重要。综上所述,本课题首次验证岩藻聚糖硫酸酯可以通过促进泡沫细胞的自噬清除ox-LDL诱导的泡沫细胞的脂质,而TFEB在其中发挥着至关重要的作用。这为泡沫细胞恢复为巨噬细胞提供了新思路和新策略,同时对岩藻聚糖硫酸酯的进一步开发利用具有重要的理论和现实意义。