近年来食物过敏发病率不断增高,据报道,全球食物过敏症发病率为4-6%,欧美9岁以下儿童食物过敏的发病率为7%-8%。95%以上儿童食物过敏与牛奶、鸡蛋、花生、大豆、麦、鱼有关,而成人通常与花生、坚果、鱼、贝壳类有关。为了快速检测食物中过敏原,以花生、大豆、核桃过敏原基因为研究对象,建立三重Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法。1、建立花生、大豆、核桃过敏原基因单个Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法。应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qRPCR）技术,建立针对大豆过敏原蛋白基因（Gly m Bd 28k）、核桃过敏原基因（Jug r 1）、花生过敏原基因（Ara h1）等常见过敏原的Taqman探针快速检测方法。经过查找比对GenBank中大豆、核桃和花生三个物种的过敏原基因,各自设计了一对特异性引物和带有不同荧光基团的探针,并建立了大豆、核桃和花生过敏原基因单个Taqman探针荧光定量检测方法,分别对退火温度、引物、探针浓度、反应体系等条件优化,得到反应体系最优条件后,进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果表明,大豆、核桃、花生单个Taqman探针实时荧光定量PCR检测特异性结果良好,只能特异性扩增出对应目的片段,标准曲线建立结果,相关系数:R_大²_豆=0.996、R_核²_桃=0.995、R_花²_生=0.999,扩增效率:E_大豆=106.4%、E_核桃=109.5%、E_花生=105.4%;质粒最低检出限,大豆:1.50×10⁰ copies/μL,核桃:1.50×10¹ copies/μL、花生:1.50×10²copies/μL;DNA混合样检出限:大豆、核桃、花生:0.1ng/μL;粗加工样品检测结果显示,随着温度升高或者时间延长,过敏原检出阈值变高;重复性结果显示,变异系数均小于2%。2、建立大豆、核桃过敏原基因二重Taqman探针荧光定量PCR检测方法。针对大豆过敏原蛋白基因（Gly m Bd 28k）和核桃过敏原基因（Jug r 1）建立二重Taqman探针荧光定量检测方法。标准曲线结果显示,相关系数:R_大²_豆=0.993,R_核²_桃=0.999,扩增效率:E_大豆=104.9%,E_核桃=98.0%,特异性试验结果显示,仅能特异性检出大豆和核桃的DNA,该方法最低检测限为大豆:1.50×10³ copies/μL,核桃:1.50×10² copies/μL,对DNA混合样品进行检测时,最低检测限为0.01ng/μL;重复性试验结果显示,组内、组间重复性的变异系数均在2%之内,粗加工样品检测结果显示,随着温度升高或者时间延长,过敏原检出阈值变高。3、建立大豆、核桃、花生三重Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法。建立的标准曲线结果显示,相关系数:R_大²_豆=0.993、R_核²_桃=0.991、R_花²_生=0.997,扩增效率:E_大豆=106.9%、E_核桃=112.1%、E_花生=108.9%;该法特异性良好,只能特异性扩增相关基因,建立的实时荧光定量PCR方法最低能够检测到质粒标准的拷贝数为大豆:1.50×10² copies/μL,核桃:1.50×10² copies/μL,花生:1.50×10³copies/μL;DNA混合样品最低检测限为大豆:0.01ng/μL、核桃:0.1ng/μL、花生:1ng/μL。且重复性试验表明,组间和组内重复性的变异系数均在2%内,说明建立的三重Taqman探针荧光定量PCR方法具有良好的重复性;粗加工样品检测结果显示,随着温度升高或者时间延长,过敏原检出阈值变高。该方法对50份市售加工食品进行检测,其中,配料含有大豆、核桃和花生的样品中均有阳性扩增信号。该研究成功建立了大豆、核桃和花生过敏原基因三重Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法,通过对市售加工食品中快速检测验证,具有特异性高,检出限低的特点。