目的:严重的眼表疾病是致盲性眼病,自体或异体角膜缘干细胞移植存在供体材料有限、术后免疫排斥等问题,限制了临床广泛应用。随着角膜组织工程技术的迅速发展,体外培养角膜缘干细胞用于眼表疾病治疗具有广阔的临床应用前景。本实验以共焦显微镜作为取材指导,进行人角膜缘干细胞体外培养、鉴定,为能成功构建人角膜缘干细胞移植片打下基础。方法:应用海德堡视网膜激光断层扫描系统3代和Rostock角膜模块(HRT3-RCM)对10例10眼术前检查患者全角膜及角膜缘进行分区扫描检查,记录角膜及角膜缘上皮层、前弹力层及前基质层的图像,对所有检查资料进行研究分析。依据共焦显微镜对角膜缘上皮层的结构分析,对眼库提供的角膜缘组织进行取材、培养,实验分为6批进行。以羊膜为载体,采用组织块培养法进行人角膜缘干细胞体外培养,观察培养细胞的生长情况,选择角膜缘干细胞的阳性标志物(p63、cytokeratin19)及其分化标记物(keratin 3、involucrin),利用免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定。结果:通过HRT3-RCM扫描发现,角膜缘上皮层细胞聚集成细长条索,呈栅栏状外观,其间可见大量高反光颗粒状物质;在基底部扫描时,观察到“细胞岛”样现象;角膜缘部位斜切面观察,上皮层下有排列整齐的乳头状突起。体外培养实验中,接种103块组织块,出膜生长74块,平均出膜率68.62±16.94%,平均出膜时间5.83±2.04天。各批之间出膜时间和出膜率存在显著性差异,排除年龄、性别构成比不同等原因,主要是由于组织块的新鲜度不同造成。利用角膜缘干细胞阳性标志物对培养细胞鉴定证实培养细胞中存在着一定比例的角膜上皮干细胞,利用其分化标记物荧光染色可以得出此培养可以维持角膜上皮细胞特性。结论:本研究以共焦显微镜作为取材指导,选择羊膜作为载体,在体外成功培养人角膜缘干细胞。