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目的:研究慢病毒介导的肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白2(TNFAIP8L2,TIPE2)表达对非小细胞肺癌(NSCLC)生长、转移的作用及其机制。方法:以携带人TIPE2编码序列(CDS)的pMD19-T/TIPE2重组克隆质粒为模板,利用人TIPE2特异性引物(TIPE2-F1:5’-GAA GCT AGC GCC ACC ATG GAG TCC TTC AGC TCAAAG-3’;TIPE2-R1:5’-ATA GGC GCG CCT CAG AGC TTC CCT TCG TCT AGC AGC-3’)通过PCR扩增约555bp的TIPE2 CDS目的片段,在Nhe I、SgsI酶切位点间插入至GFP标记的pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒质粒构建人TIPE2重组慢病毒质粒pLenti6.3/TIPE2/IRES/GFP,并经PCR、双酶切、DNA测序鉴定。然后将构建正确的pLenti6.3/TIPE2/IRES/GFP及其对照pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒质粒分别与辅助包装质粒pLP1、pLP2、VSVG用脂质体Lipofectamine2000共转染293T人胚肾细胞包装GFP标记的人TIPE2重组慢病毒(LV-TIPE2)及其对照空病毒(LV),并将慢病毒上清高速离心浓缩后,用有限稀释法根据GFP表达进行慢病毒滴度测定。利用人TIPE2特异性引物(TIPE2-F2:5’-TGA CGG CAC TTA GCT TTG GT-3’;TIPE2-R2:5’-GCA GAC CTG GGT CAG AGA AG-3’)实时荧光qRT-PCR的方法检测人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(A549、SPC-A1、H358、H1299、H292、H1650)及正常支气管上皮细胞(HBE)中TIPE2的表达水平。LV-TIPE2、LV然后分别以25MOI最佳感染剂量感染H1299、H292 NSCLC细胞,通过10μg/ml的灭瘟素(BSD)筛选后获得H1299-LV-TIPE2(简写为H1299-TIPE2)、H1299-LV(简写为H1299-mock);H292-LV-TIPE2(简写为H292-TIPE2)、H292-LV(简写为H292-mock)。上述转基因细胞及慢病毒未感染的H1299、H292细胞通过荧光显微镜、流式细胞仪检测GFP分析转基因效率,及RT-PCR、Western blot检测慢病毒介导的TIPE2表达。利用MTT、PI单染法细胞周期、Annexin V-PE/7-AAD双染法细胞凋亡、Transwell迁移、Transwell侵袭等实验检测慢病毒介导的tipe2过表达对h1299、h292nsclc细胞体外增殖、细胞周期、凋亡、迁移、侵袭的影响。建立balb/c裸鼠nsclc皮下移植瘤模型,监测肿瘤体积、重量,分析tipe2对h1299、h292nsclc细胞裸鼠体内生长的作用。并建立balb/c裸鼠nsclc尾静脉注射肺转移模型,检测tipe2对h1299、h292nsclc细胞裸鼠体内转移的作用。并采用westernblot检测tipe2对h1299、h292nsclc细胞周期相关蛋白(p21、p27)、细胞凋亡相关蛋白(bcl-2、bcl-xl、bax、bak)、上皮间充质转化(emt)相关蛋白(e-cadherin、n-cadherin、vimentin、snail1、snail2/slug)、激酶相关蛋白(akt、p-akt、erk1/2、p-erk1/2、gsk3β、p-gsk3β)表达的影响。并进一步用gsk3β抑制剂(viii)、26s蛋白酶体抑制剂(mg132)开展激酶、蛋白酶体抑制实验阐明tipe2调控akt-gsk3β-snail轴促进泛素化蛋白酶体降解、下调snail1、snail2(slug)是tipe2逆转nsclcemt、抑制nsclc转移的重要分子机制。结果:1)成功构建了人tipe2重组慢病毒(lv-tipe2);2)tipe2在人nsclc细胞中表达显著下调,在h1299、h292nsclc细胞表达更低;3)成功构建了慢病毒介导的tipe2转基因h1299、h292nsclc细胞;4)慢病毒介导的tipe2过表达能够明显抑制h1299、h292nsclc细胞体外和裸鼠体内生长;5)tipe2能够通过上调p27细胞周期素依赖激酶(cdk)抑制剂显著诱导h1299、h292nsclc细胞g1细胞周期阻滞;6)tipe2能够上调促凋亡蛋白(bcl-2、bcl-xl)/抗凋亡蛋白(bax、bak)的比例诱导h1299、h292nsclc细胞凋亡;7)tipe2能够明显抑制h1299、h292nsclc细胞体外迁移、侵袭及裸鼠体内的肺转移能力;8)tipe2能够明显下调h1299、h292nsclc细胞snail1、snail2(slug)emt诱导转录因子(emt-tfs),n-cadherin、vimentin间充质标志物及上调e-cadherin上皮标志物;9)tipe2能够明显下调h1299、h292nsclc细胞p-akt、p-gsk3β的水平;10)gsk3β、蛋白酶体抑制后均能完全削弱tipe2抑制h1299、h292nsclc细胞snail1、snail2(slug)的作用。结论:1)tipe2能够通过下调akt信号、上调g1期检查点关键分子诱导g1期阻滞及上调bcl-2家族促凋亡蛋白/抗凋亡蛋白的比例活化内源性凋亡抑制nsclc生长;2)tipe2能够通过下调snail1和snail2(slug)emt-tfs逆转nsclcemt、抑制nsclc转移;3)tipe2调控akt-gsk3β-snail轴介导的snail1、snail2(slug)泛素化蛋白酶体降解是TIPE2逆转NSCLC EMT、抑制NSCLC转移的重要分子机制。