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基于中医临床用药分析与课题组前期研究发现当归常与红花配伍用于治疗血虚血瘀证,并具有协同增效作用,因此课题组申请并获得国家自然科学基金资助项目-"当归-红花配伍养血活血量效关系与协同增效相互作用研究"(No.81274058)。本论文为该项目的部分研究内容,为了回答以下科学问题:(1)当归-红花配伍养血活血相互作用的量比范围与程度;(2)当归-红花配伍协同增效的作用机制。本论文共分为四章,各章节的主要内容及研究结果如下:第一章文献研究第一节当归系列药对的中医应用数据分析从中医方剂数据库中检索出含当归的方剂16529首,基于频次统计方法,对其配伍比例、主治疾病以及疾病所属的科属进行统计分析。结果发现,在方剂中与当归配伍频率高于200次的药物有170味,高于1500次的药物有22味。对这22个常用当归系列药对的进一步分析发现它们在方剂中都是以1:1配伍最为常见,其次是1:2、2:1和3:2;并且这些药对相关方剂所治疾病主要集中在内科与妇科。第二节当归系列药对化学成分和配伍效应研究进展本节在前期数据挖掘的基础上,系统地综述了近几年相关文献对当归主要药对的研究。第三节当归-红花药对的研究进展本节系统地综述了近几年相关课题组对当归和红花药对配伍的研究,包括化学、药效学和机制等。第二章当归-红花药对配伍药效相互作用研究第一节基于整合效应与响应曲面分析法的当归-红花药对活血功效相互作用研究采用"冰水浴+注射盐酸肾上腺素"建立大鼠急性血瘀模型,配制不同配比(1:0、4:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:4、0:1)不同浓度当归-红花药液后,观察其对血液流变学各指标的影响,采用相应的公式和算法对各指标数据进一步整合分析,从而得出当归和红花配伍后的三维响应曲面模型。结果发现当归-红花药对配比在0.8:1～1.1:1以及在当归灌胃剂量为0～5 g/kg,红花8～11 g/kg这个区域之间表现为协同作用(相互作用值:-0.2～-0.8),在当归灌胃剂量为0～0.2 g/kg,红花为0.2～1g/kg表现为拮抗作用,但拮抗作用不明显,相互作用值为0.2左右,而其他比例并未表现出明显的协同或拮抗作用。第二节基于整合效应与响应曲面分析法的当归-红花药对补血功效相互作用研究通过注射乙酰苯肼和环磷酰胺复制小鼠血虚模型,给予不同配比(1:0、4:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:4、0:1)不同浓度当归-红花药液后,观察正常组、血虚模型组和模型给药组小鼠外周血常规各指标和脏器指数(胸腺、脾脏)的变化,采用相应的公式和算法对各指标数据进一步整合分析,从而得出当归和红花配伍后的三维响应曲面模型。结果发现,当归单用剂量7.8g/kg/d时,补血效果最好,红花单用剂量0.52g/kg/d时,补血效果最好。当归和红花配伍后,当归在0.5～1.2 g/kg和红花在0～0.5 g/kg时,表现为协同作用,在大部分剂量配比范围内(50%)表现为相加作用,其次为拮抗作用。当归和红花配伍后补血效应的协同作用范围较窄,强度也不是很明显,并在一定量比时还有拮抗作用。第三章当归-红花药对体内外效应物质基础研究第一节基于UHPLC-TQ/MS法比较评价当归-红花药对不同配比的主要成分含量变化基于中医方剂数据挖掘结果和统计分析需要,本实验共选择了 9个不同配伍比例(1:0、4:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:4、0:1),并建立了采用 UHPLC-TQ-MS/MS同时测定当归-红花中的13个有效成分(6-羟基山奈酚-3,6,7-三氧葡萄糖苷,羟基红花黄色素A,绿原酸,6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷,对香豆酸,脱水红花黄色素B,阿魏酸,山奈酚-3-O-芸香糖苷,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯A,正丁基苯酞,藁本内酯,丁烯基苯酞)的分析方法,同时也对不同配比下有效成分的含量变化进行了比较分析。结果表明,随着当归量的增加,红花中各成分(6-羟基山奈酚-3,6,7-三氧葡萄糖苷,羟基红花黄色素A,6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷,对香豆酸,脱水红花黄色素B,山奈酚-3-O-芸香糖苷)含量总体有增加的趋势。随着红花量的增加,当归中各成分(绿原酸,阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯A,正丁基苯酞,藁本内酯,丁烯基苯酞)含量总体有减少的趋势。第二节当归-红花药对主要活性成分在正常和血瘀大鼠体内药代动力学比较研究本实验建立了一种灵敏可靠的UPLC-MS/MS方法用于测定大鼠灌胃后当归-红花中羟基红花黄色素A、咖啡酸、对香豆酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、阿魏酸、正丁基苯酞、藁本内酯等七种主要活性成分在血浆中的变化,同时,我们也对这七种成分在正常和血瘀模型大鼠血浆中的药动学特征进行比较。结果表明,这七种主要活性成分在某些药动学参数上具有显著性差异,提示血瘀证可能会改变药物代谢的速度和程度。第三节当归-红花药对主要活性成分在正常和血瘀模型大鼠体内代谢产物比较研究本实验采用超快速液相-三重四极杆飞行时间串联质谱(UFLC-Q-TOF/MS)结合PeakView软件对正常和模型大鼠口服HSYA后血浆,胆汁,尿液,粪便样品内代谢产物进行比较研究。结果显示,正常大鼠体内共检测和鉴定到8个代谢产物而模型大鼠只检测到7个,主要的代谢途径有羟基化,羟基化后甲基化,乙酰化,葡萄糖醛酸化,还原,水合,脱水,羟基化后葡萄糖醛酸化,M3,M5,M6和M7是主要的代谢产物,它们很有可能就是HSYA在体内发挥药理作用的形式。这些代谢产物在正常和模型大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便中分布有明显不同。第四章基于代谢组学的当归-红花药对活血作用机理研究首先,通过血液流变学指标检测,将当归-红花药对及其组成药味对急性血瘀大鼠的活血化瘀效应进行评价。然后,采用代谢组学策略,从血瘀大鼠血浆中初步鉴定得到15个潜在生物标志物,正离子模式下8个:8-异前列腺素F2a、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇葡萄糖醛酸苷、吲哚丙烯酸、溶血性磷脂酰胆碱类(LysoPC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、LysoPC(16:0)、LysoPC(18:0))、L-棕榈酰肉碱、二氢神经酰胺;负离子模式下7个:3-脱氢-L-古洛糖酸、二氢尿嘧啶、6-羟基牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、溶血性磷脂酰胆碱类(LysoPC(P-18:1(9Z))、LysoPC(O-18:0))、鞘氨醇半乳糖苷-6’-硫酸酯。与正常组比较发现,模型组中6-羟基牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、L-棕榈酰肉碱和LysoPC(O-18:0)相对丰度显著下降,其它内源性生物标志物的相对丰度则显著升高。血浆中标志物主要参与戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化,醚脂类代谢,泛酸和辅酶A的生物合成,β-丙氨酸代谢,鞘脂类代谢,淀粉和蔗糖代谢,甘油磷脂代谢,脂肪酸代谢,色氨酸代谢,嘧啶代谢共10条代谢通路。归红药对及其组成药味均可调节紊乱的生物标志物,使其向正常状态转归。归红药对的活血功效整体作用优于其单味药。