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Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶(Cs CE)能够催化单一乳糖制备乳果糖,是目前最高效的乳果糖制备用酶。针对Cs CE在酶法制备乳果糖中展现的巨大优势以及其工业化应用研究的不足,本文侧重于Cs CE的固定化研究,致力于开发一种能够用于工业化酶法制备乳果糖的固定化酶制剂。主要研究了透性化Cs CE细胞、固定化Cs CE全细胞以及固定化Cs CE的方法,同时对制备的3种生物催化剂进行了表征,并考察了三者在乳果糖制备中的应用。首先,采用乳糖诱导Cs CE在细胞内高效表达,并经乙醇透化处理制备得到透性化Cs CE细胞,然后考察透性化Cs CE细胞在乳果糖制备中的应用。结果显示:当添加12.5U/m L的透性化Cs CE细胞和600 g/L的底物乳糖时,在80℃的Na2HPO4-Na H2PO4缓冲液(50 m M,p H 7.5)中反应2 h,最终乳果糖浓度为390.6 g/L,转化率达到65.1%,且生成的依匹乳糖仅为12 g/L,转化率小于2%。然后,采用壳聚糖絮凝结合戊二醛交联的方法固定透性化Cs CE细胞,在优化的固定化条件下,絮凝效率达到90%,酶活回收率在85%以上。透性化Cs CE细胞被固定化后对底物亲和性降低,但热稳定性增强,同时表现出良好的储藏稳定性和操作稳定性,经15次重复反应后,仍保留90%以上的初始酶活。固定化Cs CE细胞作为生物催化剂应用于乳果糖制备,在Na2HPO4-Na H2PO4缓冲液(50 m M,p H 7.5)中反应2 h后,乳果糖浓度为394.7 g/L,转化率达到65.8%。最后,通过热处理实现对Cs CE的初步纯化,经70℃、2 h的热处理,Cs CE比酶活由0.89 U/mg提高到5.46 U/mg,纯化倍数为6.14倍,酶活回收率达到86.6%。结合Duolite A568树脂的吸附作用和戊二醛的交联作用,实现了对初步纯化的Cs CE的固定化。固定化Cs CE的最适p H从7.5变为7.0,Km值是游离酶的1.3倍,达到143.70±6.79 m M,固定化Cs CE重复反应15次,只损失5%的酶活,展现出较好的热稳定性和操作稳定性。在Na2HPO4-Na H2PO4缓冲液(50 m M,p H 7.0)中添加600 g/L乳糖和12.5 U/m L的固定化Cs CE,在70℃反应2 h,乳果糖产量为309.3 g/L,转化率为51.6%。