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背景卵巢癌（ovarian cancer,OC）是妇科肿瘤中致死率最高的癌症。尽管卵巢癌的治疗研究方法有很多,但是传统的放化疗和手术治疗仍然不能有效提高患者的生存率,延长患者的寿命。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的自然杀伤（natural killer,NK）细胞被发现能够有效治疗肿瘤,同时NK细胞由于缺乏T细胞受体（T cell receptor,TCR）,不会带来一系列的安全隐患,因此CAR-NK细胞被认为更有希望应用于肿瘤临床治疗。目的建立脐带血（Umbilical cord blood,UCB）和外周血（Peripheral blood,PB）源NK细胞的培养体系,构建NK-92来源的CAR-NK体系,探索脐带血来源的CAR-NK细胞对卵巢癌的作用。本实验由以下三部分组成:第一部分:脐带血和外周血源NK细胞培养体系的建立及预测NK细胞纯度模型的构建方法1.为了构建脐带血和外周血源NK细胞的培养体系,我们收集了10名产妇捐赠的脐带血和93名健康捐献者的外周血,使用体外因子诱导法培养NK细胞,流式法检测NK细胞的纯度,台盼蓝染色法检测NK细胞活率。2.在此培养体系下,NK细胞纯度存在较大的个体差异情况,为了减少个体差异,我们收集了93名志愿者138项常见的临床体检指标,随机抽取77名作为训练集,剩余16名作为测试集。在影响NK细胞纯度因素的分析中,把相关体检指标作为自变量,NK细胞纯度作为因变量,先进行单因素分析（Pearson相关性检验）筛选出P<0.05的自变量,再把这些自变量全部纳入多因素分析,多因素分析使用R语言MASS包step AIC函数进行逐步回归筛选关键变量,建立NK index模型。为了检验模型的预测价值,首先对测试集中的预测纯度与实际纯度做线性相关检测,再应用受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析NK index模型对NK细胞纯度高低的预测能力。结果我们建立了高活性的脐带血和外周血源NK细胞的培养体系,并且发现NK细胞纯度与个体异质性有关。进一步分析发现,影响NK细胞纯度的个体指标有年龄、三碘甲状腺原氨酸、红细胞体积分布宽度、红细胞分布宽度标准差、肌酐、淋巴细胞百分比、葡萄糖、嗜酸性细胞百分比、嗜酸性细胞数和血小板体积分布宽度。以红细胞分布宽度标准差、血小板体积分布宽度、葡萄糖和三碘甲状腺原氨酸作为关键变量,建立模型NK index=-164.557+2.544红细胞分布宽度标准差+3.730血小板体积分布宽度+4.389葡萄糖+10.237三碘甲状腺原氨酸。在测试集中,NK index模型的预测值与真实值的确定系数（R-Square）为0.725,P为0.001,并且NK index模型在训练集和测试集中的ROC曲线下面积分别为0.815和0.938,说明NK index模型对NK细胞纯度有较好的预测能力。第二部分:NK-92来源的CAR NK体系的构建方法通过数据库检索到了卵巢癌中高表达的抗原MSLN,以此作为CAR靶点;接着在原代卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中验证MSLN表达的情况。由于NK-92细胞获取方便和易于扩增,因此我们选用NK-92细胞作为候选细胞,探索CAR体系的构建。然后使用慢病毒转导的方法构建靶向间皮素的CAR-NK-92细胞,流式验证其转染效率,并在体内和体外验证CAR-NK-92对卵巢癌的杀伤作用。结果数据库检索发现MSLN是卵巢癌中高表达的特异抗原,同时实验验证了MSLN在原代卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中高表达,于是我们选用MSLN作为CAR靶点,构建了靶向MSLN的CAR-NK-92细胞。流式细胞术检测显示MSLN-CARNK-92纯度为70%左右,同时体内和体外实验验证了MSLN-CAR-NK-92细胞能够增强抗卵巢癌作用,并释放更多的细胞因子。第三部分:脐带血源CAR NK细胞的构建与体外杀伤功能的探索方法在上述构建的脐带血源NK细胞培养体系和CAR NK体系的基础上,使用慢病毒转导脐带血源NK细胞,使用流式细胞术检测法检测其转染效率,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）检测脐带血源CAR NK细胞对卵巢癌细胞的杀伤效率。结果流式细胞术检测结果显示,脐带血源CAR NK细胞的构建纯度为24%左右,且脐带血源CAR NK细胞显著提高了体外卵巢癌的杀伤效率。结论1.第一部分结论:脐带血和外周血源NK细胞培养体系的建立,可为探索CAR NK体系提供不同的细胞来源;同时NK细胞纯度预测模型的建立,可为后续制定CAR-NK细胞的临床回输治疗方案提供理论指导。2.第二部分结论:MSLN-CAR-NK-92显著增强了体内和体外的抗卵巢癌作用,为后续CAR-NK的研究提供了实验基础。3.第三部分结论:我们初步验证了脐带血源CAR NK细胞的体外杀伤功能,为后续进一步探索体内脐带血源的CAR NK对卵巢癌的作用提供了研究基础。