【摘 要】
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研究背景:小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,约占肺癌的15%;其侵袭转移性很强,目前尚无有效治疗方案。阐明其发生发展机制是肺癌研究领域亟需解决的关键科学问题之一。我们的前期研究显示Skp2是泛素连接酶的重要组分,介导多种抑癌蛋白的降解从而促进癌症的发生发展。已有报道MYCN(编码N-Myc蛋白)在肿瘤细胞中的扩增通常预示着预后不良,但
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研究背景:小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,约占肺癌的15%;其侵袭转移性很强,目前尚无有效治疗方案。阐明其发生发展机制是肺癌研究领域亟需解决的关键科学问题之一。我们的前期研究显示Skp2是泛素连接酶的重要组分,介导多种抑癌蛋白的降解从而促进癌症的发生发展。已有报道MYCN(编码N-Myc蛋白)在肿瘤细胞中的扩增通常预示着预后不良,但N-Myc的直接药物靶向目前仍难以实现,因此寻找替代策略靶向N-Myc势在必行。基于前期研究我们推测Skp2可能是MYCN扩增型SCLC治疗靶点,靶向Skp2可能选择性诱发肿瘤细胞凋亡,然而其具体的分子机制尚未明确。研究目的:1、研究Skp2的下调抑制N-Myc的分子机制;2、动物水平确证靶向Skp2对小细胞肺癌的治疗效果。方法:1、临床样本收集30对小细胞肺癌的病变组织及癌旁组织,以及7种小细胞肺癌细胞系和1株正常气管上皮细胞系BEAS-2B,使用Western-Blot、免疫组化、RT-PCR等方法检测N-Myc,p27和Skp2在SCLC组织和细胞中的表达。2、利用质粒构建过表达Skp2转染细胞及sh RNA低表达Skp2细胞,并运用Tunel实验,细胞划痕实验、Western-Blot等方法观察这两种细胞的凋亡、迁移和侵袭性改变。3、利用荧光素酶报告基因分析、Ch IP技术,RT-PCR等技术检测明确N-Myc与Skp2的启动子区以及p27表达的关系。4、裸鼠移植瘤动物模型,在裸鼠皮下注射过表达Skp2小细胞癌细胞及sh RNA低表达的小细胞癌细胞,一个月后观察裸鼠生存情况及移植瘤情况,并取肿瘤组织进行免疫组织化学和Western-Blot检测。结果:1、与正常组织相比,N-Myc和Skp2在SCLC中上调。相反,p27被下调。2、证实H82细胞中的Skp2成功沉默和H196细胞中的过表达。结果显示将Skp2过表达后,H196细胞凋亡减少,迁移和侵袭显著增加。3、确认N-Myc在SCLC中上调,并揭示了其转录调节Skp2以抑制p27和促进SCLC肿瘤生长的能力。4、通过沉默实验验证了Skp2/p27轴对N-Myc的影响。N-Myc过表达后SCLC细胞凋亡减少,可在Skp2沉默后逆转。5、裸鼠移植瘤动物实验:对种植瘤体直接测量,在Skp2沉默后肿瘤的重量、体积都有明显下降,与对照组比较差异明显,且Skp2敲低后,肺部转移性结节的数量减少。结论:1、确认N-Myc正向调节Skp2表达以负调节SCLC肿瘤中的p27水平。2、通过N-Myc/Skp2/p27该信号轴,阻滞Skp2的表达可能可以为SCLC的治疗带来新的机遇。
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