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衰老是一种自然规律,是不可逆转的生命进程。细胞作为生物有机体的基本单位,也在不断地新生和衰老死亡。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是研究细胞衰老机制的最有效常用的模式生物,其有很多优势:易于培养,基因组较小,遗传操作简单,存在很多与哺乳动物细胞相似的保守生化机制。
近年来转录组学方法逐渐被应用在酵母衰老研究中,能在全基因组水平考察基因表达谱。有人通过DNA芯片分析比较了复制寿命年轻的细胞和衰老细胞mRNA表达谱,发现随着衰老,细胞新陈代谢由糖酵解途径向糖异生途径和能量储存途径转变。但由于现有细胞分选技术的局限性,获得的衰老细胞的复制寿命远低于野生型单倍体酵母中位寿命,因此阻碍酵母细胞衰老的转录组学分析。
本课题分析了现有的酵母复制寿命衰老细胞的分选方法(蔗糖梯度离心分选法和磁珠分选法),并结合微流控技术,优化及设计了新的能获得复制寿命接近平均寿命的酵母衰老细胞的分选方法。此项研究能解决复制寿命衰老细胞分选难题,为后续转录组学实验提供了技术保障。
此项实验技术的优点在于实验操作简单,对酵母的正常生长无影响,过程中能做到同步显微镜观察并实时图片记录酵母细胞生长并分裂产生后代细胞的全过程,能提供酵母细胞从年轻到衰老的过程的形态学及子细胞代增时间的准确数据。并最终能获得后续转录组学实验(mRNA表达谱)所需要的能够达到甚至超过巾位寿命的复制寿命衰老的细胞,推动酵母衰老机制的转录组学研究,为衰老的遗传决定学说提供实验支持。此外,该分选系统还提供了其它分选技术所不具备的额外功能——可在酵母细胞生长的任意阶段即时加药刺激,能够为更进一步的药物刺激实验提供灵活的用药操作支持。
本课题通过将酵母细胞固定在玻片表面,用流动的培养基将新生的后代细胞带走,从而实现子母细胞的分离,最终获得后续转录组学分析所需的复制寿命同步衰老的酵母细胞。本课题尝试了三种酵母细胞固定方案:
1)牛血清白蛋白-链霉亲和素-生物素标记的酵母;
2)三维醛基基片-酵母细胞;
3)醛基基片-链霉亲和素-生物素标记的酵母细胞。
结果显示,三种固定方案都能成功的将酵母细胞连接到玻片表面,且能保持大部分细胞固定超过10小时不被冲走。
方案一的连接效率较低、稳固性差,但细胞生长分裂正常。
方案二连接效率最高、稳固性强,但细胞难以生长。
方案三,连接效率较低,稳固性高,细胞生长正常。
综合起来,方案三的固定方案优势明显,初步试验中,能在17小时中固定住大部分酵母细胞,使其正常生长并分裂后代细胞。
从2004年开始,由于酵母衰老细胞的分选技术一直没有实质性突破,所以无法获得足够数量可用于转录组学分析的、真正意义上的复制寿命衰老的酵母细胞(分裂20代及以上),无法为衰老的遗传学说提供支撑。本课题从根本上解决了一直困扰着此领域的技术难题,为酵母衰老机制研究领域提供了新的思路,为衰老理论的研究提供了可靠的实验保障。