手足口病是由肠道病毒引起的急性传染病,以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染为主。EV71病毒和CA16病毒它们的共同特点为：病毒颗粒大小为24-30nm,无外膜、单股正链RNA、四种颗粒蛋白(VP1-VP4)形成的五聚体、六聚体构成病毒颗粒衣壳。而EV71病毒感染更加倍受关注,因为它往往会导致严重的并发症,甚至死亡,其致死原因主要为严重的神经病变,如脑干脑炎及无菌性脑膜炎。CA16病毒感染较EV71感染症状轻,但能与EV71病毒合并感染并且交替流行,近年来也颇受观注。这些年来,手足口病在亚太地区频繁暴发,已逐渐成为一种潜在的危害全球公共健康的疾病。快速有效的诊断能够预防疾病传播,减少病人死亡。诊断肠道病毒感染的方法有病毒分离,核酸检测,血清学检测。本研究主要内容是通过实时荧光PCR、病毒分离及中和实验诊断方法,对2009年～2011年珠江医院手足口病人进行病原学检测,从而分析CA16病毒三年来流行特点；同时通过对CA16病毒VP1基因测序后构建基因进化树,分析2010年CA16病毒基因型,为CA16病原的流行趋势,及进化规律提供参考；根据2009-2011年手足口病人的临床资料,分析不同肠道病毒导致心肌酶谱变化关系；此外,对收集的手足口病人血清进行CA16-IgM及EV71-IgM抗体检测,分析CA16-IgM抗体变化动态规律及其与不同肠道病毒感染血清IgM抗体的交叉反应。通过对这些病原学资料及血清学的研究,了解手足口病CA16病毒流行趋势及基因进化规律,对疾病的流行及暴发起到预防监控作用。因此,本研究分为以下两大章节：第一章2009-2011年广州地区儿童手足口病柯萨奇病毒A16型(CA16)流行病学调查2009-2011三年间南方医科大学珠江医院住院及门诊临床诊断为手足口病患者共1239例,其中男813例,女426例,门诊病人525例,住院病人714例,平均年龄35个月。收集这些病人的临床资料、肛拭子及血清标本。病人的临床资料包括年龄、性别、发病时间,发病症状,心肌损伤指标,标本采集时间。肛拭子标本共采集1239份,另从住院患者中随机获取血清标本497份。所有肛拭子标本进行实时荧光PCR检测,部分标本进行病毒分离后实时荧光PCR验证。2010年13株CA16病毒液及CA16临床肛拭子标本进行VP1基因扩增测序,随后进化树分析。收集的497份急性期及恢复期血清,全部进行心肌酶谱检测。心肌酶谱检测指标包括：谷草转氨酶(AST)、肌酸肌酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)。2009-2011年所有临床诊断手足口病病人中年龄最大35岁,最小1个月。说明成人儿童均可能感染手足口病。从三年的结果来看这些患儿年龄集中在5岁以内,发病高峰在1-3岁,0-1岁儿童感染例数较少。这可能是因为0-1岁儿童母体抗体的存在,导致其不易感染,发病率较低,而5岁以内儿童免疫系统还不完善,免疫力较低下,又无母体抗体的保护,成为手足口病的高发人群。从性别来看2009-2011年所有临床诊断手足口病患儿男女比例分别为：2.34：1、1.87：1及1.88：1。其中CA16病毒感染患者男女比例分别为：2.75：1、1.49：1及2.57：1。这些结果均显示男性感染的机率高于女性,这可能是因为男孩比女孩好动,增加密切接触肠道病毒感染物品及相互接触传染的机会。本院所采集的肛拭子标本实时荧光PCR结果显示：2009年所有临床诊断手足口107例,检出94例为肠道病毒感染,13例为阴性,检出率87.85%；2010年所有临床诊断手足口553例,检出505例为肠道病毒感染,48例为阴性,检出率91.32%；2011年所有临床诊断手足口579例,检出515例为肠道病毒感染,检出率88.95%。三年中CA16病毒感染引起的手足口病分别占所有肠道病毒感染手足口病的43.69%(45/94)、19.80%(122/505)及20.00%(107/515)。这些数据表明CA16病毒是手足口病感染的主要病原之一,尤其2009年广州地区流行的手足口病原以CA16为优势血清型,近两年有所下降。从时间分布来看广州地区2009年手足口病发病高峰在4-6月；2010年手足口病发病始于3月份,发病高峰在4-7月,峰值在5月份；2011年手足口病发病高峰在5-8月份,峰值在6月份,11月份也有一个发病小高峰,所以其曲线图呈现“双峰”形状。2009、2010年CA16病毒的流行情况与当年总的临床诊断手足口病流行情况相似；2011年CA16病毒发病始于5月份,高峰在7-12月,峰值在11月。从临床症状来看,根据2010年版的《卫生部手足口病诊疗指南》,2010年手足口病重症49例,CA16病毒引起的重症手足口病2例,占4.08%,2011年手足口病重症48例,只有1例是由CA16病毒引起,占2.08%。可见CA16病毒感染引起手足口病一般症状较轻,极少导致重症。将部分实时荧光PCR检测为CA16病毒标本进行病毒分离培养后再用实时荧光PCR重新分型验证。2009年、2010年CA16病毒共分离58例,阳性数为26,总的分离阳性率为44.83%(26/58)。经3代盲传,病毒分离培养出现病变效应的细胞上清实时荧光PCR初步鉴定,检测结果与原始标本实时荧光定量PCR检测结果一致。进一步确认原始标本为CA16病毒。我们可以发现病毒分离方法,检测敏感性较低。对所收集的497份临床诊断手足口病人血清进行心肌酶谱检测。发病0-7天内血清为急性期血清,大于7天收集的血清为恢复期血清,其中7-14天内为恢复期(早期)血清。再将这些血清按照患者感染的不同病毒种类分为三种：EV71病毒感染组、CA16病毒感染组以及其它肠道病毒感染组。EV71病毒、CA16病毒以及其它肠道病毒感染者急性期心肌标志物异常率分别为26.60%、44.19%及45.54%。经统计学分析,三种病毒心肌标志物异常率有差别(χ2=14.136,P=0.001),且CA16病毒感染组急性期血清心肌标志物异常率高于EV71病毒感染组。这一结果表明,CA16病毒感染可能更易侵犯心肌细胞,引起心肌损伤。结合上面的临床症状分析结果,相比之下,EV71病毒感染更易导致重症,引起中枢神经系统损伤。CA16病毒感染组急性期与恢复期(早期)比较,心肌指标CK、CK-MB差异有显著意义(CK:t=3.621, P=0.000; CK-MB:t=3.390, P=0.001);相比这下,EV71病毒感染组两个指标均无差异(CK:t=1.715,P=0.088; CK-MB:t=-1.221, P=0.223)。从这一结果我们可以发现CA16病毒感染一周后,心肌损伤有所恢复。尽管EV71病毒感染患者心肌标志物异常率低于CA16病毒感染患者,但一旦发生心肌损伤,其恢复较慢。此外,我们还对2010年的CA16病毒株进行基因进化树分析。19株CA16病毒成功扩增并对13株病毒VP1基因进行测序,发现这13株均属于B1型,其中4株为B1b,另9株为B1a,表明病毒存在一定变异和重组或具有不同祖先来源。这13株病毒株的VP1区段与已登录Genbank的广东CA16序列比较：与2005年以前广东深圳CA16序列比较,亲缘关系稍远,与2009年深圳毒株比较,亲缘关系较近,原因可能是广东深圳两地地理位置较近,但早期毒株可能由不同祖先进化,而近期两地毒株可能存在共同祖先；与台湾地区CA16毒株比较结果,亲缘关系也稍远,表明毒株可能进化来源不同。第二章CA16-IgM抗体动态规律分析2009年3月至2010年11月南方医科大学珠江医院实验室诊断为手足口病人中随机抽取230人,其中男156人,女74人,年龄范围为4～169个月,中位年龄26个月。收集这些病人从入院至出院的系列血清,共收集434份急性期和恢复期血清,血清采集时间从发病第一天至158天不等。另获得75例呼吸道病毒感染病人系列血清105份。采用捕获ELISA法检测这些血清。实时荧光PCR方法检测肛拭子标本将病毒分类分为：EV71病毒、CA16病毒及其它肠道病毒。其它肠道病毒以及呼吸道病毒感染患者血清再通过中和实验验证其为非EV71、CA16病毒感染。我们对CA16病毒感染患者血清进行捕获酶联法检测进而分析CA16-IgM抗体的动态变化规律。结果为：发病第一天检出率25%,发病第二天37%,发病第三天67%,发病第五天达86%,直到发病第八天,血清CA16-IgM抗体检出率可达100%。CA16-IgM抗体可以在发病第一天检出,并且可以持续数周。发病20周后,IgM抗体检出率迅速下降。发病90天后,4份血清中只有一份为弱阳性(S/Co=1.09)。另一方面,通过对EV71病毒、其它肠道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清进行CA16-IgM捕获ELISA检测,分析其交叉反应。CA16-IgM捕获ELISA检测结果：211份EV71病毒感染患者血清中58份阳性,其它肠道病毒感染患者48份血清中16份阳性,呼吸道病毒感染患者血清105份中3份检测阳性。我们将全部66例CA16病毒感染病人119份血清分别进行EV71-IgM捕获ELISA和CA16-IgM捕获ELISA检测。检测结果表明30.3%(36/119)的CA16病毒感染病人血清,EV71-IgM抗体检测阳性,存在交叉。然而这36份交叉血清中有33份(91.7%) CA16-IgM抗体捕获ELISA检测OD450值高于EV71-IgM抗体捕获ELISA检测。尽管存在交叉反应,但联合两种方法检测,比较其OD450的比值,可以成功区分是CA16病毒感染还是与EV71病毒的交叉反应导致的假阳性。为了比较CA16-IgM酶联法与实时荧光PCR检测法的一致性,我们将同一天收集的肛拭子标本和血清标本检测结果进行比较评价。结果：两种方法检测CA16病毒感染无差异(McNemar检验P=0.148),但是Kappa value=0.276(P=0.000),相关系数偏低,表明两种方法相关性不是很好。总的来说CA16-IgM捕获ELISA检测CA16病毒感染是一种简易、经济的诊断方法。小结根据以上两章节的研究,小结如下：1.对2009-2011年手足口病流行病学调查,分析三年间CA16病：毒的流行概况。2009、2010及2011年广州地区手足口病以CA16病毒感染占所有肠道病毒感染手足口病患者的47.87%(45/94)、19.80%(122/505)及20.00%(107/515)。广州地区由CA16病原导致的手足口病有所下降。2.2009、2010年CA16病毒的流行情况与当年总手足口病流行情况相似,发病高峰在4-7月；2011年CA16病毒感染导致手足口病始于5月,高峰在7-12月。三年间所有手足口患儿及CA16感染导致的手足口病均为男性患儿高于女性患儿。患儿发病年龄集中在5岁以内,5岁以内所有手足口病患儿及CA16病毒感染患儿的比例分别为：92.11%、96.35%。3.CA16病毒感染患儿急性期心肌酶标志物异常率高于EV71感染患儿。CA16病毒感染患儿急性期(0-7天)与恢复早期(8-14天)CK-MB均有差异。EV71病毒感染患儿急性期与恢复早期CK-MB统计无差异。这一结果表明CA16病毒比EV71病毒可能更易亲嗜心肌细胞,但心肌酶标志物恢复正常较EV71病毒感染快。4.对13株2010年CA16病毒VPl基因扩增后测序,进化树分析结果为B1型。说明2010年广州地区流行的CA16病毒可能为B1型。5. CA16-IgM抗体动态规律研究表明：CA16-IgM抗体不仅可以在发病第一天产生,并且可以持续数周,直到发病第八天,血清CA16-IgM抗体检出率可达100%。发病20周后,IgM抗体检出率迅速下降。发病90天后,4份血清中只有一份检出很微弱的阳性(S/Co=1.09).6.由于肠道病毒间存在一些同源性,有共同的氨基酸序列,故CA16-IgM检测存在一定交叉反应。分别对EV71病毒、其它肠道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清进行CA16-IgM捕获ELISA检测,检测结果阳性率分别为：27.48%(58/211)、33.33%(16/48)及2.86%(3/105)。尽管存在交叉反应,但联合EV71-IgM及CA16-IgM捕获ELISA两种方法检测,比较其OD450的比值,可以成功区分是CA16病毒感染还是与EV71的交叉反应导致的假阳性。7.对来自同一天收集的肛拭子标本及血清标本进行检测,比较实时荧光PCR与CA16-IgM捕获ELISA方法一致性,统计结果表明两种方法没有差异,但相关系数不高。总之,CA16-IgM酶联检测法可以在手足口病大规模流行时进行早期诊断复查,适合在没有开展分子生物学诊断方法的基层医院使用。