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流行性感冒(Influenza)是由流感病毒(Influenza virus)引起的一种人畜共患的呼吸道传染病。流感病毒分为A型、B型和C型,其中A型(甲型)流感病毒最为常见。A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一种分节段的单股负链RNA病毒,它的每个基因片段分别编码不同的蛋白。流感病毒具有高度传染性,能在短时间内迅速蔓延,严重危害人类健康,引起严重的公共卫生安全。巨噬细胞是抗感染免疫中起关键作用的多功能免疫细胞,广泛存在于多种组织中,主要参与病原体识别、清除、抗原加工和呈递、炎症和组织修复以及免疫调节等功能。另一方面,巨噬细胞也是一些病毒直接攻击的靶标细胞,它可以被某些病毒调节和利用,并作为病毒复制增殖、储存及运输的容器和载体,从而有利于病毒感染的建立、传播及长期在组织内持久存在。因此,巨噬细胞是研究病毒感染与宿主细胞免疫反应机制的重要工具和模型,然而关于稳定的流感病毒巨噬细胞直接感染的模型还未有报导。本研究的主要目标是探究巨噬细胞在抗流感病毒感染中的作用及其介导的机制,本研究构建了流感病毒小鼠巨噬细胞感染模型,为研究流感病毒免疫逃逸、调控宿主细胞免疫反应机制及抗流感病毒免疫相关等方面打下良好的基础。通过免疫荧光方法检测在分离自流感病毒感染的小鼠巨噬细胞中流感病毒的抗原表达;利用小鼠骨髓巨噬细胞BMM,用流感病毒PR8毒株(H1N1)感染BMM细胞,用Western-blot和qRT-PCR方法分别检测流感病毒蛋白在BMM细胞中的抗原及病毒特异mRNA的表达,在蛋白水平方面用Western-blot方法进一步研究流感病毒在巨噬细胞中的复制动力学,并探究LPS/TLR4通路是否影响流感病毒在BMM细胞中的复制。在感染后30 h的时间过程中分析了流感病毒在小鼠BMM中的复制动力学,结果显示流感病毒在感染24 h的时候达到复制峰值,此后下降。此外,通过免疫细胞荧光实验,在接种了流感病毒的小鼠的腹腔巨噬细胞和肺及脾巨噬细胞中均能特异检测到病毒蛋白NP的表达。以LPS刺激BMM细胞用以激活TLR4路径实验表明该路径对流感病毒在BMM细胞中的复制影响很小,说明流感病毒在BMM细胞中的复制是LPS-TLR4通路激活非依赖性的。之后进一步在病毒感染的BMM细胞提取液中免疫沉淀流感病毒核蛋白NP,用于蛋白质谱鉴定与NP蛋白互作的宿主细胞蛋白,并对所得到的蛋白数据进行初步分析,结果显示某些与NP蛋白互作的BMM细胞蛋白参与RIG-I受体、Fcγ受体等信号通路。这为之后进一步研究流感病毒复制增殖及巨噬细胞的抗病毒免疫反应的机制提供了基础。结论:本研究成功建立了流感病毒H1N1巨噬细胞感染模型,包括流感病毒H1N1在巨噬细胞中的复制动力学及LPS/TLR4信号通路对流感病毒在BMM细胞中复制的影响。并初步鉴定了与流感病毒核蛋白NP相互作用的宿主细胞因子。这些结果为后续研究巨噬细胞在抗流感病毒感染免疫及分子机制打下了坚实的基础。