【摘 要】
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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)属于双子叶植物唇形科鼠尾草属,又称红根、大红袍等。《神农本草经》、《本草纲目》等记载具有活血化瘀、调经等功效,此外对神经性衰弱失眠、冠心病、关节痛等也有疗效。丹参的有效药用成分有亲水性的酚酸类物质和亲脂性的丹参酮类物质。近年来,CK2已被广泛研究和显示可以磷酸化300多种已知的底物蛋白,参与多种发展途径,植物蛋白激酶CK2对于植物底物的磷酸
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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）属于双子叶植物唇形科鼠尾草属,又称红根、大红袍等。《神农本草经》、《本草纲目》等记载具有活血化瘀、调经等功效,此外对神经性衰弱失眠、冠心病、关节痛等也有疗效。丹参的有效药用成分有亲水性的酚酸类物质和亲脂性的丹参酮类物质。近年来,CK2已被广泛研究和显示可以磷酸化300多种已知的底物蛋白,参与多种发展途径,植物蛋白激酶CK2对于植物底物的磷酸化作用具有稳定增长的趋势。本研究以丹参为模式材料,克隆丹参Sm CK2基因,并运用生信软件对丹参Sm CK2基因及蛋白序列进行分析,使用酵母双杂交、pull down、Western blot等方法对丹参CK2与丹参转录因子Sm MYB36、Smb HLH128之间的互作进行研究,尝试探讨丹参Sm MYB36、Smb HLH128蛋白的翻译后修饰问题,为丹参次生代谢途径的研究提供一定数据支撑。1对丹参Sm CK2进行生信分析,得到Sm CK2由碳、氢、氧、氮、硫五种元素构成,蛋白均为疏水性蛋白,Sm CKA1、Sm CKA2、Sm CKA3、Sm CKA4为弱碱性蛋白,Sm CKB1、Sm CKB2为弱酸性蛋白。Sm CK2均不具有信号肽和跨膜结构域,不具有糖基化修饰。Sm CKA1、Sm CKA2、Sm CKA3、Sm CKA4定位于细胞核和线粒体基质空间,Sm CKB1、Sm CKB2定位于线粒体内膜和溶酶体上,还有部分在细胞质中起作用,二维和三维结构预测表明Sm CK2以α螺旋为主,并伴有无规则螺旋。2克隆丹参CK2基因,将Sm CK2片段构建到酵母表达载体p GBKT7,得到p GBKT7-Sm CKA1、p GBKT7-Sm CKA2、p GBKT7-Sm CKA3、p GBKT7-Sm CKA4、p GBKT7-Sm CKB1、p GBKT7-Sm CKB2。酵母双杂交验证发现Sm CK2不具有自激活活性。将Sm CK2片段构建到酵母表达载体p GADT7,得到p GADT7-Sm CKA1、p ADKT7-Sm CKA2、p GADT7-Sm CKA3、p GADT7-Sm CKA4、p GADT7-Sm CKB1、p GADT7-Sm CKB2后,与p GBKT7-Sm CKA1、p GBKT7-Sm CKA2、p GBKT7-Sm CKA3、p GBKT7-Sm CKA4、p GBKT7-Sm CKB1、p GBKT7-Sm CKB2分别进行酵母双杂交实验,发现丹参Sm CK2家族成员之间Sm CKB2与Sm CKA1、Sm CKA3、Sm CKB1存在互作关系。Sm CKB1与Sm CKB2各自分别自身发生耦合互作用。3将p GBKT7-Sm MYB361-153和p GBKT7-Smb HLH128?TAD分别与p GADT7-Sm CKA1、p ADKT7-Sm CKA2、p GADT7-Sm CKA3、p GADT7-Sm CKA4、p GADT7-Sm CKB1、p GADT7-Sm CKB2进行酵母双杂交实验,发现丹参Sm CKA2、Sm CKB1、Sm CKB2与丹参Sm MYB36存在互作,丹参Sm CKB1与丹参Smb HLH128存在互作。4将Sm CKA2片段构建到原核表达载体p ET32a,得到大小为66 k Da的Sm CKA2蛋白。通过pull down技术发现丹参Sm CKA2与丹参Sm MYB36存在互作。5将Sm MYB36和Smb HLH128片段构建到原核表达载体p ET32a,得到p ET32a-Sm MYB36、p ET32a-Smb HLH128,得到大小为36 k Da和83 k Da的Sm MYB36和Smb HLH128蛋白。与蛋白激酶CK2孵育,通过Western blot验证Sm MYB36能够被蛋白激酶CK2磷酸化。6将丹参Sm MYB6蛋白中的CK2磷酸化位点全部突变后,通过cell-free体系对其进行蛋白降解实验发现,蛋白稳定性明显增加,证明蛋白激酶CK2对丹参Sm MYB36蛋白的磷酸化促进了其通过26S蛋白酶体的降解。
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