【摘 要】
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黄姑鱼（Nibea albiflora）作为中国近海比较常见的经济鱼类,在中国东海、黄海、渤海和南海均有广阔分布,然而,因为过度捕捞以及海洋环境的严重破坏,黄姑鱼野生资源逐渐衰退,其增养殖业逐渐发展起来,但由于种质因素及养殖环境的恶化,不可避免地导致养殖黄姑鱼疾病频繁发生。病原感染和机体免疫应答是病害发生的两个重要环节,这就要求我们在针对病原开发新型抗菌药物及处理方法的基础上,从机体本身入手,研究
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黄姑鱼（Nibea albiflora）作为中国近海比较常见的经济鱼类,在中国东海、黄海、渤海和南海均有广阔分布,然而,因为过度捕捞以及海洋环境的严重破坏,黄姑鱼野生资源逐渐衰退,其增养殖业逐渐发展起来,但由于种质因素及养殖环境的恶化,不可避免地导致养殖黄姑鱼疾病频繁发生。病原感染和机体免疫应答是病害发生的两个重要环节,这就要求我们在针对病原开发新型抗菌药物及处理方法的基础上,从机体本身入手,研究机体中与免疫防御密切相关的基因,弄清病原与机体免疫分子的相互作用机制,探讨如何以免疫分子为切入点,提高机体的抗逆能力和培育新的抗病养殖品种,进而促进黄姑鱼养殖业的可持续发展。巨噬细胞上富有胶原结构的清道夫受体（MARCO）是清道夫受体A家族（SRA）中较为重要的基因,在生物的天然免疫系统中起重要作用,但是目前关于MARCO的报道还很少,海洋鱼类中关于该基因的研究还不够彻底。因此,本文对黄姑鱼清道夫受体家族重要成员MARCO进行了鉴定,并对其系统进化、表达特征和亚细胞定位等开展研究,主要取得的研究结果如下所示:1、基于黄姑鱼转录组数据设计引物,克隆获得清道夫受体A家族MARCO基因（命名为 NaMARCO,GenB ank 登录号:MN243703.1）的 cDNA 全长 1788 bp,其开放阅读框（ORF）为1266 bp,编码421个氨基酸。多序列比对及系统发育树分析表明,NaMARCO的氨基酸序列与其他石首鱼科的成员的MARCO具有高度同源性。尤其与大黄鱼在SR结构域及跨膜区等特殊基序高度保守,推测它们的免疫功能上也具有相似性。2、在肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、鳃和胃六种组织中均能检测到NaMARCO的表达,在脾脏中表达量最高,其次是肾脏,在胃中表达量最低。3、NaMARCO基因在大黄鱼源杀香鱼假单胞菌胁迫后48 h表达量最高（为对照组0h的9.86倍）,在PolyI:C胁迫后2 h即表现出最高表达量（为对照组0h的5.17倍）,在溶藻弧菌胁迫后12 h表达量达到最大值（为对照组0h的20.20倍）,在副溶血弧菌胁迫后4 h表达量达到峰值（为对照组0 h的10.98倍）,所有胁迫组随时间的延长表达量逐渐下调。作为对照,PBS注射组表达变化不明显。结果表明NaMARCO在黄姑鱼抗菌免疫防御发挥重要作用。4、通过质粒载体构建,进一步对NaMARCO进行亚细胞定位分析,结果显示,NaMARCO与绿色荧光蛋白融合表达的重组表达产物主要表达在鲤鱼上皮细胞（EPC细胞）的细胞膜上,在细胞核周围的内质网及其他细胞器膜中亦有少量表达,说明NaMARCO作为典型的膜受体在黄姑鱼中可能担任识别病原菌的作用。5、为了验证所使用的致病菌是否可以引起黄姑鱼免疫反应,本实验从黄姑鱼转录组数据中挑取SOD、CAT、GST、HSP70四种免疫应激因子作为实验对象,研究表明在溶藻弧菌和副溶血弧菌刺激黄姑鱼后,SOD在溶藻弧菌胁迫下12 h表达量最高（为对照组0 h的11.33倍）,在副溶血弧菌胁迫下8h达到最大值（是对照组0 h的8.61倍）;CAT在溶藻弧菌胁迫下2h即达到最高表达量（为对照组0h的10.94倍）,在副溶血弧菌胁迫下于4 h达到最大值（为对照组0h的4.46倍）;GST在溶藻弧菌胁迫下24 h表达量达到最高（为对照组0 h的13.30倍）,在副溶血弧菌胁迫下24 h表现为最大值（是对照组0h的12.47倍）;HSP70在溶藻弧菌胁迫下12 h表达量达到最高（是对照组0h的18.44倍）,在副溶血弧菌胁迫下48 h达到最高（为对照组0h的8.15倍）。通过分析上述数据可知,本论文中使用的水产病原菌能激起黄姑鱼免疫反应,4种免疫应激因子亦如NaMARCO一样参与了黄姑鱼机体免疫防御。上述实验结果表明,NaMARCO作为典型的清道夫受体A家族的膜受体,在机体的天然免疫功能发挥过程中亦如应激分子一样扮演着重要的角色,在其抗菌感染中发挥着重要的作用,因此,本文实验结果为今后研究天然免疫分子功能机制提供重要依据,也为揭示黄姑鱼等海洋鱼类的健康养殖提供理论指导。
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