流感病毒是有囊膜的、分节段的单股负链RNA病毒,属于正黏病毒科(Orthomyxoviridαe),是重要的人畜共患病原。根据流感病毒核蛋白和基质蛋白的抗原性差异,可将其分为A、B、C、D四种类型,其中A型流感病毒危害最大,其宿主范围广泛,可通过基因重排和点突变产生新的流感病毒,曾引发多次流感大流行和季节性流感,严重威胁人类健康和经济发展。流感病毒具有种属特异性,不同物种来源的流感病毒结合的唾液酸受体类型不同,通常情况下禽流感病毒仅结合禽源受体,人流感病毒仅结合人源受体。然而近年来,多种亚型禽流感病毒感染人事件层出不穷,如H5、H6、H7、H9和H10亚型,其中H5N1和H7N9病毒感染人的致死率分别为～60%和30%,造成巨大损失。从病毒和其宿主角度来说,有许多因素决定禽流感病毒的跨种传播,其中的一个关键因素是病毒囊膜表面决定其受体结合特性的血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)的变异。流感病毒感染宿主的第一个步骤依赖HA蛋白识别并结合宿主细胞表面的唾液酸受体,而HA上一些氨基酸的突变可能引起受体结合特性发生转变,从而为跨种传播提供可能性。因此,阐明流感病毒HA蛋白的受体结合特性对流感病毒防控工作具有重要指导意义。自2013年起,H7N9亚型禽流感病毒已引起1600多人感染,并于2017年出现一些高致病性禽流感毒株。之前的研究表明,人源H7N9病毒具有双受体结合特性,并且初步确定了 HA蛋白上的A138/V186/P221/L226或V186/L226是其人源受体结合特性的关键决定位点,但各个氨基酸在其中所起的作用以及病毒获得人源受体结合特性的演化过程仍不清楚。因此,本研究通过分析带有不同氨基酸组合的H7N9HA突变体的受体结合特性、蛋白稳定性、病毒的复制能力等特点,从分子层面解释H7N9流感病毒的跨种传播机制。我们发现目前流行的H7N9病毒依旧具有双受体结合特异性,与2013年的A/Anhui/1/2013(H7N9)(简称AH1)分离株类似。H7亚型HA蛋白上G186V的单一突变足以使其获得人源受体结合能力,而在其它亚型中的标志性突变Q226L并非其决定性位点。不过这一位点可能在病毒的进一步适应中起重要作用。另外,受体结合位点上的138/186/221/226这四个位点为疏水氨基酸时会导致H7N9 HA蛋白的稳定性降低,其中以G186V和Q226L的作用最为显著。这表明H7N9禽流感病毒是以牺牲HA蛋白稳定性为代价来获得人源受体结合能力的。基于结构分析,186位氨基酸的侧链可影响190-helix上E190侧链的走向,从而影响HA与受体的相互作用,而L226在没有其它三个疏水氨基酸(A138,V186和P221)搭配的情况下会降低220-loop的稳定性,从而降低HA对于人源和禽源两种受体的亲和力。这些结果表明H7N9 HA的蛋白稳定性和受体结合能力在一定程度上可相互补偿,共同决定病毒的适应性以及进化过程。在2013年H7N9疫情暴发早期,HA分子的135位主要为A,226位主要为L,而在2017年出现的H7N9病毒中,其135位主要为V,而226位Q的比例略有增多,造成这一差异的原因也尚不清楚。为了研究这一变异对H7亚型HA性质的影响,我们分析了 A135V和L226Q突变前后HA受体结合特性的变化及其与人源H7N9病毒抗体(4A-14,3A44)的结合情况。结果显示,A135V和L226Q单突变或双突变都不改变H7N9 HA的双受体结合特性,但是降低了 HA与3A44抗体的结合能力。另外,GD-8H324毒株的HA中158位氨基酸的糖基化也会影响HA与4A-14抗体的结合。这些结果表明2017年的H7N9 HA发生了免疫逃逸突变,对H7N9病毒暴发早期的抗体不敏感。综上所述,H7N9禽流感病毒的进化可能是由抗体的选择压力、受体结合特性、病毒蛋白的稳定性以及其它可能因素共同选择的结果。这些研究有利于深入理解H7亚型禽流感病毒跨种传播的分子机制,对于流感病毒疫情的预防与控制具有重要指导作用。