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背景与目的：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)是口腔颌面部最多发的恶性肿瘤，发病率占口腔颌面部恶性肿瘤的80％以上。最近几十年来，虽然以外科治疗、化疗、放疗技术为主的肿瘤综合治疗日臻成熟，但是口腔鳞癌患者的长期生存率(5年生存率)以及肿瘤局部复发和远处转移的发生率并无明显改善。
人类恶性肿瘤的发生发展过程中涉及到多种基因的表达和功能的异常。目前多项研究已证实基因的异常表达在肿瘤的发生发展过程中起非常重要的作用，甚至可以在某种意义上认为恶性肿瘤即为基因疾病。所以运用基因手段将是治疗恶性肿瘤的希望。
RNA干扰(RNA interference)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过RNA调控基因表达的机制。siRNA具有高度的序列特异性和强大的抑制基因表达的效应。RNAi己被证明是极具潜力的基因治疗手段和研究基因功能的重要工具，在基础和临床的研究中具有广泛的应用前景。
磷脂酰肌醇激酶-3家族(PI3Ksfamily)是一类调节信号通路的脂酶，与肿瘤形成、细胞的增殖、粘附、存活和迁移等相关，磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α基因(PIK3CA)则是P13Ks家族的关键成员。PIK3CA定位于3q26.32，含20个外显子，编码1068个氨基酸，其功能是催化4，5*PIP2成为3，4，5-PIP3。研究提示PIK3CA在多种肿瘤中存在高频的细胞突变，是与多种肿瘤发生发展相关的癌基因。所以PIK3CA可望作为肿瘤早期诊断和基因治疗的理想靶标。基因治疗必须通过适当的基因转移技术将外源基因转移至特定细胞内。高效的基因转移方法是基因治疗的关键和基础。逆转录病毒载体是目前基因治疗中应用最广的载体，慢病毒载体与简单的逆转录病毒载体相比，具有转移基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应、安全性较好、不仅能感染分裂细胞还能感染不分裂细胞、稳定整合于靶细胞的基因组、治疗基因表达时间长等优点。慢病毒载体已成为当前基因治疗中转移载体的研究热点。
本研究通过制备有效的靶向hPIK3CA shRNA，将其重组、构建至慢病毒载体，感染Tca8113细胞后检测其对肿瘤细胞的靶向基因沉默效率，探讨其在口腔鳞癌治疗中的应用前景。
方法和结果：
第一部分：靶向hPIK3CA RNAi质粒载体的制备
方法：hPIK3CA—shRNA质粒载体的构建和鉴定：选取由上海吉凯基因化学技术有限公司设计并合成的针对hPIK3CA的siRNA序列(NO：DBLV08340)以及通用阴性对照序列，设计合成shRNA oligo，进行退火最终合成含有干扰序列的带有粘性末端的双链DNA oligo，使用PAGE凝胶检测双链形成效率；以Hpa I/Xbo I对含RNA聚合酶ⅢU6启动子的载体质粒-pGCL-GFP进行双酶切消化，形成不对称的粘性末端；双链hPIK3CA shRNA oligo表达框架与pGCL-GFP连接；转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序。
结果：针对确定的靶点信息合成的单链shRNA oligo，退火后形成带粘性末端的双链DNA oligo。酶切载体质粒pGCL-GFP后，质粒由超螺旋状态转化形成线性化状态，并形成与上述双链sNRNA框架相匹配的粘性末端。将上述两种双链连接、重组。转化感受态细胞DH50α，于含有MgSO4和Amp抗性的SOB琼脂培养基上培养并筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行PCR鉴定和测序。
结果提示：得到完全符合实验设计要求的RNAi表达质粒载体体系。
第二部分：靶向hPIK3CA慢病毒载体RNAi系统的制备
方法：慢病毒载体的制备和滴度测定：该慢病毒载体系统由有效序列载体质粒：pGCL-GFP—hPIK3CA shRNA、包装质粒pLV-Packaging(pHelper1.0)、包膜质粒pLV-Envelope(pHelper2.0)组成。将上述三质粒共转染293T细胞，收获并浓缩制备慢病毒颗粒。逐孔稀释测定法进行病毒滴度测定。
结果：开始几乎所有的细胞均表达GFP，随着病毒浓度的下降，荧光细胞比例也相应减少。计算出荧光细胞比例为10％左右的孔中荧光细胞个数，将其除以相应的稀释倍数就得到Lenti—hPIK3CA PSC340的病毒滴度为：8.0×107TU／ml。
第三部分：靶向hPIK3CA慢病毒载体RNAi系统抑制人舌鳞癌Tea8113细胞的实验研究
方法：Lenti—hPIK3CA PSC340感染Tca8113细胞后hPIK3CA基因沉默效率的检测：在MOI=2.5的条件下将Lenti—hPIK3CA PSC340慢病毒载体系统转导Tca8113细胞。感染3天后于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，5天后收集细胞，运用Real time RT-PCR检测目的基因的mRNA表达情况；以及细胞凋亡相关基因：Caspase-9 mRNA转录表达水平；感染病毒5天后MTT法检测Tca8113细胞生长水平；感染病毒5天后流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。评价RNA干扰hPIK3CA基因的干扰效果。数据以SPSS v16.0软件行one-way ANOVA单因素方差分析，将p<0.05定为差异有统计学意义。
结果：Lend—hPIK3CA PSC340感染Tca8113细胞后hPIK3CA基因沉默效率的检测：感染3天后于荧光显微镜下观察GFP的表达情况：密集绿色荧光细胞可见于NC、KD组，证明hPIK3CA shRNA表达框架成功转导进入Tca8113细胞。5天后收集细胞，抽取RNA，运用Realtime RT-PCR检测：经GAPDH内参校正，KD组hPIK3CA表达水平明显下降，较NC组的hPIK3CA敲减效能为：72.20％(p<0.05)； Caspase-9的表达较CON组与NC组明显上调：48.30％(p<0.05)；CON组与NC组比较，hPIK3CA、Caspase-9表达水平无显著性差异(p>0.05)。MTT法检测细胞生长水平：5天后KID组细胞生长明显抑制，平均细胞生长抑制率为30.31％；NC组对Tca8113细胞生长水平无抑制作用。流式细胞仪检测提示：未见显著调亡发生。
结论：
1.成功制备靶向hPIK3CA RNAi慢病毒载体，病毒滴度：8.0×103 TU／ml。
2.以5’-ATGTTTACTACCAAATGGA-3’序列设计的RNAi可有效、特异性地沉默hPIK3CA基因的转录和表达水平。
3.转导第五天hPIK3CA mRNA表达水平特异性下降：72.20％。Caspase-9表达上调：48.30％。
4.转导5天后Tcaa8113细胞生长水平明显抑制，但未见显著调亡发生。