对卵母细胞进行冷冻保存，能够充分利用卵源，为体外受精、核移植和转基因等胚胎工程技术的研究和应用提供充足的实验材料。由于猪卵母细胞中含有丰富的脂滴，对低温非常敏感，对它的研究也可为其它低温敏感性物种的卵母细胞冷冻保存提供参考。本实验以体外成熟的猪卵母细胞为研究对象，研究了冷冻保护剂对卵母细胞的毒性作用，并在此基础上研究了冷冻保护剂、细胞松弛素B(CB)处理时间、冷冻载体和脱脂方法对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响。 为了评价冷冻液对猪MⅡ期卵母细胞的毒性作用，将卵母细胞分别用15％EG(乙二醇)、15％DMSO(二甲基亚砜)和15％ED(7.5％EG+7.5％DMSO)的预处理液分别处理卵母细胞2min和5min，再通过30％EG、30％DMSO和30％ED(15％EG+15％DMSO)的玻璃化冷冻液处理30 s，不经冷冻直接脱除冷冻保护剂，然后进行孤雌激活和培养，对照组卵母细胞在体外培养成熟后直接进行孤雌激活和培养。结果发现，15％EG处理2rain组卵裂率和囊胚率(93.7％和16.0％)与对照组(97.2％和20.6％)差异均不显著(P>0.05)：15％ED处理2 min组卵裂率(92.05％)与对照组差异不显著(P>0.05)，但其囊胚率(15.1％)显著低于对照组(P<0.05)；用15％DMSO处理2 min组的卵裂率和囊胚率(85.9％和11.3％)显著低于对照组(P<0.05)；所有处理5 min组的卵裂率和囊胚率均显著低于对照组(P<0.05)。结果表明，采用15％EG预处理猪体外成熟的卵母细胞2 min毒性最小，ED次之；预处理5 min对卵母细胞的毒性明显大于预处理2 min，预处理时间延长会增加对卵母细胞的毒性。 采用15％EG或15％ED预处理2 min对卵母细胞进行玻璃化冷冻，以不经冷冻保护剂和冷冻的卵母细胞为对照组。结果发现，EG组与ED组的形态完整率(85.9％和87.8％)和存活率(65.9％和63.2％)均无显著差异(P>0.05)，但显著低于对照组(100％和198.6％)(P<0.05)。说明两种冷冻保护剂对猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻后形态和存活的影响相似。 分别在冷冻保护剂EG处理前用细胞骨架稳定剂CB处理卵母细胞15 min、30 min和45min，结果发现：解冻后的形态完整率、存活率和孤雌激活后的卵裂率差异均不显著(P>0.05)，与对照组(不用CB处理冷冻组)的差异也均不显著(P>0.05)。但从结果看，采用CB处理30 min组卵母细胞的形态完整率、存活率和卵裂率均稍高(82.8％、62.7％和16.4％)。用CB处理45 min不能进一步提高冷冻效果。 利用不同的冷冻承载工具(载体)开展猪MⅡ期卵母细胞冷冻试验发现，开放性拉长麦管(Open Pulled Straw，OPS)和半麦管法冷冻的卵母细胞在解冻后其存活率和卵裂率差异不显著(P>0.05)，但均显著高于麦管法(P<0.05)，说明OPS法和半麦管法更适合用于猪MⅡ期卵母细胞的冷冻保存。卵母细胞在离心并显微操作去脂、离心脱脂后冷冻和不脱脂直接冷冻并孤雌激活后的卵裂率差异均不显著(P>0.05)，但显著低于对照组(P<0.05)；采用离心显微操作去脂的方法冷冻后的卵母细胞囊胚率(11.4％)显著高于离心冷冻和不离心直接冷冻组(0％)(P<0.05)，与对照组(26.1％)差异不显著(P>0.05)。说明离心并显微操作脱脂滴的方法可以显著提高猪MⅡ期卵母细胞的发育能力，并可发育囊胚，而只离心不通过显微操作去脂的方法不能增加冷冻效果。 综合本试验的结果表明，猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻时，用OPS作为载体，采用CB处理，离心并显微操作去脂滴，15％EG预处理2 min，30％EG的玻璃化冷冻液处理30 s后，可以获得较好的继续发育能力。