研究目的由于创伤、感染、肿瘤等因素所致的骨缺损、畸形愈合、延期愈合或骨不连等一直是威胁人类身体健康的医学问题,所以大段节段性骨缺损的修复仍是一个重要的临床问题。当前临床治疗方法主要包括骨材料移植(自体移植,同种异体移植或异种移植)、各种生物材料的植入,骨传输生长方法,但是这些技术均存在一定的缺陷和不足。而骨组织工程技术的发明应用则为人类治愈骨不连带来了希望,但如何构建一个近似生理条件的组织工程骨是组织工程领域的研究重点。带有血供和神经支配的骨移植物对大段骨缺损有明确的修复效果,因为充足的血液供应是保证组织工程骨存活的先决条件；而完善的神经支配起到调节与反馈作用,因而也是构建理想组织工程骨的要素之一。本课题组前期的大量实验研究显示在组织工程骨中植入血管束可以有效促进新生骨形成,另有实验研究证实植入感觉神经束也能促进新生骨形成。一方面,植入的血管束和感觉神经可以为支架材料上的种子细胞提供氧气和营养,另一方面,血管束和感觉神经束可以释放多种神经肽,这些神经肽可能通过作用在种子细胞细胞膜上的神经肽受体调节种子细胞的增值和分化。本研究通过检测血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨内神经肽受体的表达情况,为今后研究骨形成与血管、神经再生相互关系提供一定的实验依据。实验方法第一部分兔来源的骨髓间充质干细胞和向成骨分化的骨髓间充质干细胞中神经肽受体的表达研究1.抽取健康新西兰大白兔双侧髂骨处抽取红骨髓,用全骨髓培养法原代培养骨髓间充质干细胞(Marrow mesenchymal cells, BMSCs),培养至第3代时,取一部分BMSCs向成骨方向诱导培养21天。并检测碱性磷酸酶和钙结节鉴定分化方向。2.分别取培养至第3代的BMSCs和成骨诱导培养的BMSCs,按照试剂盒说明进行免疫荧光染色(FITC)检测降钙素基因相关肽Ⅰ型受体(Calcitonin gene related peptide type I receptor, CGRP1R), P物质Ⅰ型受体(Neurokinin-1 receptor, NK1R),神经肽Yl型受体(Neuropeptide Y type I receptor, NPY1R)和VIP1型受体(Vasoactive intestinal peptide type I receptor, VIPR1)在细胞中的表达情况。3.分别取培养至第3代的BMSCs和成骨诱导培养的BMSCs,随后行常规总RNA的提取,并取总RNA样本进行电泳检测。另取各组总RNA逆转录合成cDNA。在荧光定量PCR仪上进行扩增,以β-actin作为内参物,计算CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1的相对表达强度。第二部分血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损对神经肽受体的短期表达研究1.健康新西兰大白兔54只,5个月龄,雌雄不限,体重2～3kg,购自南方医院实验动物中心。按随机数字表法分为感觉神经束植入组(Ⅰ组)、血管束植入组(Ⅱ组)、单纯组织工程骨对照组(Ⅲ组),每组各18只。每只兔于双侧髂骨处抽取红骨髓5ml(内含骨髓间充质干细胞),将骨髓间充质干细胞(BMWCs)经过原代培养(全骨髓培养法)、传代培养,取第3代骨髓间充质干细胞向成骨方向诱导7天后,按4×106～6×106个/ml的密度,采用负压吸引接种法将细胞接种到多孔β-磷酸三钙支架上(每个支架细胞数约1×106个),体外构建组织工程骨。2.于所有动物左侧股骨前外侧做一纵形切口,逐层分离显露股骨。于股骨前外侧放置已塑形好的6孔普通钢板,于钢板第2、3孔之间用线锯截取1.5cm长股骨,在骨缺损处植入组织工程骨(自体BMSCs构建)后逐层缝合伤口。再于股骨内侧中央做一小的纵切口,逐层显露,在股三角内显露和分离出隐神经和股血管束,将隐神经游离适当长度后远端锐性切断并植入组织工程骨的侧槽内,为Ⅰ组；将股血管束游离适当距离后无须切断,顺行植入组织工程骨侧槽内并用普理灵线固定,为Ⅱ组；同时游离出大隐神经和股血管束,但不植入侧槽内,为Ⅲ组(空白对照组)。3.于术后第4、8、12w将动物(每组每个时间点6只)术区摄X光片(投照距离lm,投照条件46KV,50mA,曝光时间0.14s),观察骨缺损愈合情况与材料降解情况,并根据修复骨缺损的情况的进行评分。4.于术后第4、8、12w处死每组2只动物,完整截取组织工程骨段股骨,行大体标本观察。以40g/L多聚甲醛固定,150g/L乙二胺四乙酸脱钙后石蜡包埋,行5μm连续横行及纵行切片,切片标上序号,分别进行HE染色和Masson染色,对比观察成骨和血管生成情况。此外,按SABC试剂盒说明书行免疫组织化学染色检测CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1的表达情况,用已知CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1阳性表达的切片作阳性对照,PBS液代替抗液作阴性对照。每只动物随机取4张相同序数的CGRP1R、NK1R、NPY1R, VIPR1免疫组化染色切片,光镜下观察阳性表达部位与表达强弱并拍照。5.于术后第4、8、12w处死每组4只动物,迅速剔除组织工程骨周围软组织,在组织工程骨两端与正常骨交界处、组织工程骨中点共3个位置钳取新鲜骨组织约40mg,加入1ml Trizol液研磨,用枪吹打几次,尽量让细胞全部裂解,室温放置5分钟,随后按照试剂盒说明书进行常规总RNA的提取,并取总RNA样本进行电泳检测。另取各组总RNA 3μL,按逆转录kit操作步骤合成cDNA。在荧光定量PCR仪上进行扩增,反应条件如第一部分所述。采用2一△△Ct法,以β-actin作为内参物,计算CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1的相对表达强度。引物序列如第一部分所述。6.数据处理及统计学分析靶基因的表达量F=2—△△ct,△△ct=(待测样品的目的基因的ct的平均—待测样本的看家基因的ct的平均)—(对照样品的目的基因的ct的平均一对照样本的看家基因的ct的平均)。7.利用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学处理,用3×3析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应做统计,若有显著性差异则用单向方差分析(One-way ANOVA)对同一时间点各组间的mRNA表达量值和同一组间不同时间点的mRNA表达量值进行比较,并用LSD法行多重比较分析。P<0.05为具有显著性差异。第三部分血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损对神经肽受体的中长期表达研究1.健康新西兰大白兔36只,5个月龄,雌雄不限,体重2-3kg,购自南方医院实验动物中心。按随机数字表法分为感觉神经束植入组(Ⅰ组)、血管束植入组(Ⅱ组)、单纯组织工程骨对照组(Ⅲ组),每组各12只。每只兔于双侧髂骨处抽取红骨髓5ml(内含骨髓间充质干细胞),如第二部分所述进行原代培养,成骨诱导培养,采用负压吸引接种法将细胞接种到多孔p-磷酸三钙支架上(每个支架细胞数约1×106个),体外构建组织工程骨。2.动物模型的制备和分组详见第二部分。3.于术后第24,48w将动物(每组每个时间点6只)术区摄X光片(投照距离lm,投照条件46KV,50mA,曝光时间0.14s),观察骨缺损愈合情况与材料降解情况,并根据修复骨缺损的情况的进行评分,并联系第二部分的评分,得出一个连续的评分走形趋势。4.于术后第24,48w每组处死2只动物,完整截取组织工程骨段股骨,行大体标本观察。HE和Masson染色检测成骨情况,免疫组织化学染色检测CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1的表达情况,方法同前。5.于术后第24,48w每组处死4只动物,迅速剔除组织工程骨周围软组织,在组织工程骨两端与正常骨交界处、组织工程骨中点共3个位置钳取新鲜骨组织约40mg,加入1ml Trizol液研磨,用枪吹打几次,尽量让细胞全部裂解,室温放置5分钟,随后按照试剂盒说明书进行常规总RNA的提取,用荧光定量PCR法检测各组CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1 mRNA的表达情况,并可联系第二部分的对应的结果,得出一个短期到长期的表达水平的趋势。6.数据处理及统计学分析靶基因的表达量F=2—△△ct,△△ct=(待测样品的目的基因的ct的平均—待测样本的看家基因的ct的平均)—(对照样品的目的基因的ct的平均一对照样本的看家基因的ct的平均)。7.利用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学处理,用3×2析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应做统计,若有显著性差异则用单向方差分析(One-way ANOVA)对同一时间点各组间的mRNA表达量值和同一组间不同时间点的mRNA表达量值进行比较,并用LSD法行多重比较分析。P<0.05为具有显著性差异。结果第一部分兔来源的骨髓间充质干细胞和向成骨分化的骨髓间充质干细胞中神经肽受体的表达研究1.原代培养后第5天,在倒置显微镜下可见细胞成集落样生长,细胞形状成长梭形,培养第7天细胞长满培养瓶,并行传代培养,传代后细胞增值增快。成骨诱导分化第3代细胞后,细胞的增值明显减慢,细胞形状变为多角形,碱性磷酸酶染色呈阳性,阳性部位位于胞浆内；茜素红染色示钙结节染色阳性。2.免疫荧光染色检测神经肽受体在BMSCs和成骨诱导培养21天的BMSCs上表达的观察结果：荧光倒置显微镜下可见绿色的各神经肽受体荧光染色阳性表达位于细胞核周围的胞膜上,呈点片状分布。3.荧光定量PCR检测神经肽受体mRNA在BMSCs和成骨诱导培养21天的BMSCs上表达的结果：BMSCs和成骨诱导培养21天的BMSCs均能检测出各神经肽受体mRNA的表达。第二部分血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损对神经肽受体的短期表达研究1.X线观察：术后4周后,各组骨缺损处的材料影密度降低,材料周围均有模糊的骨痂影,而工Ⅲ组(空白对照组)的骨痂量少于各实验组；术后8周后,各组的骨痂量进一步增加,但Ⅲ组(空白对照组)的骨痂量仍少于各实验组,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)骨缺损处的材料开始被吸收降解；术后12周后,Ⅱ组(血管束植入组)的骨痂量开始减少,开始进入塑形期,而Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)的骨痂量仍有增多的迹象,各组骨缺损处的生物材料有明显的被吸收和降解的痕迹。X线评分示：不同时间之间X线评分值有显著性差异(F=100.854,p=0.000)在三组均如此,F值分别为44.148,29.757,32.801,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的X线阻射值均有显著性差异(F=29.377为p=0.000),在三个时间点内均如此,F值分别为4.876、21.628、9.656,均为p<0.05,不同时间点和分组之间存在着交互效应(F=3.986,p=0.007)。各组随着时间的延长X线评分值逐步升高；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,在4周时,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)间无统计学差异(p>0.05),而Ⅱ组(血管束植入组)的评分明显高于Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)的评分(p<0.05),在8周和12周时,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的评分值之间无统计学差异(p>0.05),而高于Ⅲ组(空白对照组)的评分(p<0.05)。2.组织学检测成骨情况(HE和Masson染色)：HE染色中粉红色的区域为新生骨组织,内可见骨陷窝和成骨细胞；而在Masson染色中,绿染的区域为新生胶原组织。显示随着时间的延长,各组成骨的面积也进一步增加,在个时间点,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的成骨面积均要多于Ⅲ组(空白对照组)。3.免疫组织化学检测CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1在组织工程骨中的表达情况：4周时,Ⅰ、Ⅱ两组(感觉神经植入组和血管束植入组)神经肽受体表达的位置相同,多在血管和骨髓处,新生骨边缘,成骨细胞周围和骨膜处也有少量阳性表达,Ⅲ组(空白对照组)在新生骨边缘发现有少量表达。随着时间推移(8周,12周),三组在新生骨成骨细胞边缘、血管周围、骨髓内的表达量也增加,表达强度Ⅲ组(空白对照组)为最弱。4.荧光定量PCR检测CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1的mRNA在组织工程骨中的表达情况：(1) CGRP1R:不同时间之间CGRP1R表达量有显著性差异(F=114.028,p=0.000),在三组均如此,F值分别为75.265,58.831,60.946,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的CGRP1R表达量均有显著性差异(F=704.531,p=0.000),在三个时间点内均如此,F值分别为393.510、290.439、157.263,均为p<0.05,不同时间点和分组之间存在着交互效应(F=4.231,p=0.009)。Ⅰ组和Ⅱ组(感觉神经植入组和血管束植入组)的CGRP1R表达量随着时间呈先升高后降低的趋势,Ⅲ组(空白对照组)CGRP1R表达量随着时间呈先逐渐升高趋势；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的CGRP1R表达量要高于Ⅰ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的CGRP1R表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。(2) NK1R:不同时间之间NK1R表达量有显著性差异(F=141.636,p=0.000),在三组均如此,F值分别为60.993,61.634,30.602,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的NK1R表达量均有显著性差异(F=972.247,p=0.000),在三个时间点内均如此,F值分别为578.477、632.202、164.934,均为p<0.05,不同时间点和分组之间存在着交互效应(F=11.272,p=0.000)。NKIR表达量随着时间呈现逐渐升高趋势；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的NKIR表达量要高于Ⅰ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的NKIR表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。(3) NPY1R:不同时间之间NPY1R表达量有显著性差异(F=256.544,p=0.000),在三组均如此,F值分别为125.793,74.177,99.460,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的NPY1R表达量均有显著性差异(F=1006.545,p=0.000),在三个时间点内均如此,F值分别为395.125、849.587、138.529,均为p<0.05,不同时间点和分组之间存在着交互效应(F=14.049,p=0.000)。Ⅰ组和Ⅱ组(感觉神经植入组和血管束植入组)的NPY1R表达量随着时间呈先升高后降低的趋势,Ⅲ组(空白对照组)NPY1R表达量随着时间呈先逐渐升高趋势；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的NPY1R表达量要高于Ⅰ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的NPY1R表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。(4) VIPR1:不同时间之间VIPR1表达量有显著性差异(F=74.521,p=0.000),在三组均如此,F值分别为20.774,89.201,17.486,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的VIPR1表达量均有显著性差异(F=94.285,p=0.000),在三个时间点内均如此,F值分别为19.909、49.558、28.377,均为p<0.05,不同时间点和分组之间存在着交互效应(F=12.820,p=0.000)。VIPR1表达量随着时间呈先逐渐升高趋势；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的VIPR1表达量要高于Ⅰ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的VIPR1表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。第三部分血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损对神经肽受体的中长期表达研究1.X线观察：术后24周后,X线显示各组的生物材料已经降解和吸收,各组的骨痂量较12周有了明显的减少,已经开始塑形阶段,而Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)组织工程骨植入区已经部分骨髓腔再通,塑形程度要优于Ⅲ组(空白对照组),Ⅲ组(空白对照组)钢板对侧的骨皮质还没有完全连续。术后48周,Ⅰ组(感觉神经植入组),Ⅱ组(血管束植入组)和Ⅲ组(空白对照组)的骨塑形程度进一步加强,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)组织工程骨植入区已经完全骨髓腔再通,骨皮质顺滑,和正常骨类似,而Ⅲ组(空白对照组)的骨皮质和正常骨相比,骨皮质相对紊乱。X线评分示：不同时间之间X线评分值有显著性差异(F=63.268,p=0.002),在三组均如此,F值分别为19.600,29.901,16.610,均为p<0.05；从各时间点看,每一时间点各组的X线阻射值均有显著性差异(F=26.031,p=0.000),在二个时间点内均如此,F值分别为9.150、20.472,均为p<0.05,不同时间点和分组之间不存在着交互效应(F=0.131,p=0.878)。各组随着时间的延长X线评分值逐步升高；对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,在24周和48周时,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的评分值之间无统计学差异(p>0.05),而高于Ⅲ组(空白对照组)的评分(p<0.05)。2.组织学检测成骨情况(HE和Masson染色)：HE染色中粉红色的区域为新生骨组织,内可见骨陷窝和骨细胞,同正常骨组织。在24周和48周两个中长期时间点,各组的骨痂明显被吸收完全,切片呈光滑骨皮质包裹骨髓腔状,和正常骨组织类似。在个时间点,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的成骨皮质厚度均要大于Ⅲ组(空白对照组)。Masson染色中,绿染的区域为新生胶原组织,而红染则为成熟胶原组织。各组在绿染组织内镶嵌着部分红染的骨组织,此形态同正常骨组织。在24周和48周两个中长期时间点,各组的骨痂明显被吸收完全,切片呈光滑骨皮质包裹骨髓腔状,和正常骨组织类似。在个时间点,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的成骨皮质厚度均要大于Ⅲ组(空白对照组)。3.免疫组织化学检测CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1在组织工程骨中的表达情况：四种神经肽受体(CGRP1R、NK1R、NPY1R、VIPR1)在各实验组各时间点表达的位置和强度,肉眼观测它们之间并无明显差异。24周时,各组神经肽受体多表达于骨皮质内的小腔隙周围,血管腔周围,骨细胞周围表达,其中Ⅲ组(空白对照组)在表达的强度和数量比Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)要低。随着时间推移(48周),三组阳性表达的位置和强度与24周相比在肉眼观察下无明显差异,而阳性表达的强度和数量Ⅲ组(空白对照组)为最弱,比Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)要低。4.荧光定量PCR检测CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1的mRNA在组织工程骨中的表达情况：(1) CGRP1R:不同时间之间CGRP1R表达量无显著性差异(F=3.149,p=0.093),在三组均如此,F值分别为4.809,0.354,0.220,均为p>0.05；从各时间点看,每一时间点各组的CGRP1R表达量均有显著性差异(F=70.817,p=0.000),在两个时间点内均如此,F值分别为52.604、26.081,均为p<0.05,不同时间点和分组之间无交互效应(F=0.664,p=0.527)。对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的CGRP1R表达量要高于Ⅰ组和Ⅲ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的CGRP1R表达量与Ⅲ组(空白对照组)无统计学差异(p>0.05)。(2) NK1R:不同时间之间NK1R表达量无显著性差异(F=0.655,p=0.429),在三组均如此,F值分别为0.404,0.121,0.247,均为p>0.05；从各时间点看,每一时间点各组的NK1R表达量均有显著性差异(F=298.914,p=0.000),在两个时间点内均如此,F值分别为186.233、124.068,均为p<0.05,不同时间点和分组之间无交互效应(F=0.026,p=0.947)。对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的NK1R表达量要高于Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的NK1R表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。(3) NPY1R:不同时间之间NPY1R表达量无显著性差异(F=0.502,p=0.488),在三组均如此,F值分别为0.026,0.065,0.671,均为p>0.05；从各时间点看,每一时间点各组的NPY1R表达量均有显著性差异(F=103.464,p=0.000),在两个时间点内均如此,F值分别为83.247、36.481,均为p<0.05,不同时间点和分组之间无交互效应(F=0.121,p=0.887)。对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,Ⅱ组(血管束植入组)的NPY1R表达量要高于Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的NPY1R表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。(4) VIPR1:不同时间之间VIPR1表达量无显著性差异(F=1.815,p=0.195),在三组均如此,F值分别为0.150,0.293,2.400,均为p>0.05；从各时间点看,每一时间点各组的VIPR1表达量均有显著性差异(F=25.593,p=0.000),在两个时间点内均如此,F值分别为16.543、10.174,均为p<0.05,不同时间点和分组之间无交互效应(F=0.259,p=0.774)。对每一时间点用LSD法进行多重比较可见,在24周时,Ⅱ组(血管束植入组)的VIPR1表达量要高于Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的VIPR1表达量要高于Ⅲ组(空白对照组)(p<0.05)。；在48周时,Ⅱ组(血管束植入组)的VIPR1表达量要高于Ⅰ组和Ⅲ组(p<0.05),而Ⅰ组(感觉神经植入组)的VIPR1表达量与Ⅲ组(空白对照组)无统计学差异(p>0.05)。结论1. BMSCs和成骨诱导培养的BMSCs均有CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1的表达,阳性表达位于细胞膜。2.用real-time PCR的方法可以用来检测骨组织中某些因子的mRNA表达,所以能够作为骨组织分子水平的检测方法。3.各时间点中,Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的成骨效果,均优于Ⅲ组(空白对照组)。4.短期观察中,4周,8周,12周免疫组化结果显示,CGRP1R, NK1R, NPY1R, VIPR1的表达量,Ⅲ组(空白对照组)的均比Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)最低,多表达在新生骨膜处成骨细胞和小腔隙周围,新生血管周围也可见有阳性表达。5.各组在短期的各时间点(4,8,12周)均检测到有神经肽受体的mRNA表达,实验组各神经肽受体mRNA的表达量在第8周的时候表达最多,并且Ⅱ组(血管束植入组)>Ⅰ组(感觉神经植入组)>Ⅲ组(空白对照组)。6.术后24周,48周各组的成骨评分均随时间推移而增加。各组术后24周,48周的X线显示Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的成骨效果优于Ⅲ组(空白对照组),结构更接近于正常骨组织,髓腔再通明显。7.术后24周,48周的组织学检测表明三组的成骨结构均与正常骨组织类似,其中Ⅲ组(空白对照组)骨皮质略薄8.术后24周,48周针对各神经肽受体的免疫组化染色表明各组各受体的阳性表达的分布与正常骨组织的类似,多表达在皮质中的小腔隙周围,成骨细胞周围和骨髓。Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的阳性表达分布和表达强度比Ⅲ组(空白对照组)广,24周和48周相比,阳性表达的强度和分布无明显差异。9.实时荧光定量PCR表明术后24,48周Ⅰ组(感觉神经植入组)和Ⅱ组(血管束植入组)的神经肽受体mRNA水平与12周的表达水平大约持平,表达趋于平稳。其中Ⅱ组(血管束植入组)的神经肽受体mRNA水平为三组中最高。