葡萄糖代谢紊乱可引起脂质代谢异常,改善葡萄糖代谢紊乱后,脂代谢紊乱也可能会得到相应改善;反之,改善脂代谢异常也可能使糖代谢紊乱得到改善。糖尿病是一种葡萄糖代谢紊乱的疾病,往往伴随有脂质代谢异常,而脂质代谢紊乱是心血管疾病的一个高危险因素。目前治疗糖尿病的药物很少直接对动脉粥样硬化有效。动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)引起的心脑血管疾病严重威胁人类健康,其发病率正逐年升高,成为当前亟待解决的首要健康问题之一。As的发病是一个多因素参与的复杂病理过程,其中巨噬细胞脂质过量蓄积和血管壁炎症反应是其核心环节。因此,减少巨噬细胞内胆固醇蓄积和抑制血管壁炎症反应对As的防治具有重要意义。合成化合物NO-1886(世界卫生组织2003年公布的俗名为ibrolipim,WHO Drug Information 2003,17(1):55)是本课题组与日本德岛大塚制药厂合作研究开发的一种脂蛋白脂酶(LPL)活化剂。NO-1886能提高血浆LPL活性,并且在降低血浆甘油三酯浓度的同时升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度。NO-1886也可减轻给予高脂饮食后患中等程度糖尿病肥胖小鼠的胰岛素抵抗。这些结果提示长期应用NO-1886可能对改善葡萄糖代谢具有较好的效果。为了探讨NO-1886调节糖代谢和脂代谢的作用及其相关作用机制,我们建立了两个细胞模型(HepG2细胞胰岛素抵抗肝细胞模型;THP-1巨噬细胞脂质蓄积模型)和一个广西巴马小型猪糖代谢和脂代谢紊乱动物模型。在此基础上,主要采用形态学、生物化学和分子生物学技术,从整体、细胞、分子和基因水平对NO-1886调节糖代谢和脂代谢的作用及机制进行研究。第一部分NO-1886对胰岛素抵抗Hep G2细胞糖原合成的影响及其机制目的:血浆游离脂肪酸浓度增高是引起胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要危险因素,但是游离脂肪酸诱导胰岛素抵抗的机制目前尚不明确。有研究显示,游离脂肪酸抑制胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖转运和肝脏糖原合成可能是由于胰岛素信号损伤所致。此外,脂蛋白脂酶异常与血脂代谢紊乱、肥胖和胰岛素抵抗的发生关系密切。实验证明,NO-1886(二乙基苯基磷酸脂衍生物)具有很强的活化脂蛋白脂酶的作用。它能够提高动物脂肪、心肌和骨骼肌组织中LPLm RNA的表达和LPL活性,升高肝素后血浆LPL活性和数量,降低血糖、血浆甘油三酯,升高高密度脂蛋白胆固醇水平;促进脂质氧化,抑制脂质蓄积,减轻胰岛素抵抗。本研究通过体外培养Hep G2细胞建立胰岛素抵抗肝细胞模型。观察NO-1886对Hep G2细胞糖原合成的影响;研究NO-1886改善Hep G2细胞糖原代谢的机制;探讨NO-1886在PI3-K/Akt/GSK-3信号通路调节肝糖原代谢中的重要作用。方法:体外培养,利用高浓度棕榈酸诱导建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型。用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养上清液中葡萄糖消耗量;用高碘-希夫氏染色和蒽酮比色法检测细胞内糖原含量;用酶比色法检测细胞培养上清液中游离脂肪酸的含量。用逆转录-聚合酶链式反应检测细胞内Akt1、Akt2、GSK-3α、GSK-3β、PI3-Kp85、PI3-Kp110、LPL、β-actin、GAPDH的表达。用Western blot免疫印迹实验检测细胞内PI3-Kp85、Akt2、GSK-3β、P-GSK-3βser9的表达。结果:用棕榈酸诱导Hep G2细胞胰岛素抵抗,结果显示,0.5mmol/L的棕榈酸处理Hep G2细胞48h后,细胞上清液中葡萄糖消耗量显著降低,游离脂肪酸含量增加,细胞内糖原含量显著降低。细胞中LPL、PI3-Kp85m RNA表达下调,GSK-3βm RNA表达上调,对PI3-Kp110、Akt1、Akt2、GSK-3αm RNA表达无明显影响。GSK-3β蛋白表达上调,P-GSK-3βser9表达下调,对PI3-Kp85、Akt2蛋白表达无明显影响。细胞培养基中加入10μmol/L脂蛋白脂酶活化剂NO-1886处理24h能够增加上清液中的葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量;降低上清液中游离脂肪酸的含量。NO-1886呈浓度依赖性上调细胞中LPL、PI3-Kp85m RNA表达,下调GSK-3βm RNA和蛋白的表达,上调P-GSK-3βser9的表达。PI3-K特异性抑制剂LY294002能够上调Hep G2细胞GSK-3β的表达,NO-1886对其具有下调作用。结论:脂蛋白脂酶活化剂NO-1886能够增加Hep G2细胞糖原合成。NO-1886增加细胞内糖原合成可能与调节PI3-K/Akt/GSK-3信号通路有关。第二部分NO-1886对THP-1细胞脂质蓄积和炎症介质表达的影响及其机制目的:观察NO-1886对THP-1巨噬细胞脂质蓄积和炎症介质表达的影响及机制。方法:在每次实验前用160nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24h,使其诱导分化成巨噬细胞后,换无血清培养基培养后加处理因素。采用RT-PCR检测THP-1巨噬细胞LPL m RNA表达,LPL活性检测试剂盒检测THP-1巨噬细胞LPL活性,油红O染色观察THP-1巨噬细胞脂质蓄积,ELISA及q RT-PCR检测THP-1巨噬细胞IL-1β,IL-8,IL-6及TNF-αm RNA表达及蛋白表达,RT-PCR和Western blot检测THP-1巨噬细胞PPAR-γ基因和蛋白的表达。结果:NO-1886明显上调了THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞LPL的表达和活性,增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、PPAR-γm RNA及蛋白的表达,与LPL的上调成平行关系,促进细胞的脂质蓄积;用PPAR-γ的拮抗剂GW9662可以部分抵消NO-1886的上调作用。结论:NO-1886能够促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积和炎症介质的表达,该效应可能与PPARγ途径的激活,来促进LPL基因的表达有关。第三部分NO-1886对糖尿病小型猪肾脏脂质蓄积及脂蛋白脂酶的影响目的:观察NO-1886对高糖高脂高胆固醇(HSFCD)饮食喂养的小型猪肾脏LPL表达和脂质蓄积的作用。方法:广西巴马小型猪分别喂养基础饲料(CD组)、高糖高脂高胆固醇饲料(HSFCD组)、高糖高脂高胆固醇饲料加1.0%NO-1886(HSFCD+NO-1886组)喂养5个月。每个月末测量体重、血浆葡萄糖、胰岛素、脂质、脂蛋白脂酶活性和尿微量白蛋白。检测肾组织LPL活性、甘油三酯及胆固醇的含量,油红O染色观察肾脏脂质蓄积,实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组化检测肾组织LPL m RNA和蛋白的表达。结果:高糖高脂高胆固醇饲料诱发广西巴马小型猪体重增加、高血糖、高胰岛素血症、高脂血症和尿微量白蛋白,增加血浆脂蛋白脂酶活性,降低肾脏LPLm RNA和蛋白的表达和活性,肾组织甘油三酯和胆固醇含量增加,肾组织LPL活性降低。NO-1886降低高糖高脂高胆固醇饲料喂养的小型猪的体重、血浆葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和尿微量白蛋白浓度,增加血浆总胆固醇和HDL-C,抑制肾组织甘油三酯和胆固醇的蓄积,增加饮食诱导广西巴马小型猪肾组织LPL的表达和活性。结论:NO-1886增加肾组织LPL的表达和活性、抑制肾脏脂质蓄积而发挥保护作用,因此,肾组织LPL表达和活性的增加,在改善饮食诱导的广西巴马小型猪肾脏脂质蓄积和蛋白尿中至关重要。