论文部分内容阅读
本文利用PCR技术体外扩增了大肠杆菌DH5α染色体DNA中的苹果酸脱氢酶的编码基因、质粒pEGFP-C1中的增强型绿色荧光蛋白的目标基因以及牛胰腺全DNA组中的核糖核酸酶A的DNA，并通过BamHⅠ与HindⅢ酶切位点将其与质粒载体pET28a连接，构建出pET28a的重组质粒(pET28a-MDH，pET28a-EGFP和pET28a-RNase A)。将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，分别得到可以启动T7 promoter表达目标蛋白质(MDH和EGFP)的基因工程菌(aMN3和aEN5)。通过对表达菌培养时间、最佳诱导时机等条件的优化，得到表达菌aMN3的最佳诱导条件：菌体37℃培养4h后加入1mmol/L IPTG，37℃诱导9h；表达菌aEN5最佳诱导条件：菌体37℃培养4h后加入1mmol/L IPTG，37℃诱导3h。对表达产物的分析发现，高效表达的目标蛋白产物(MDH和EGFP)在菌体内主要以包涵体形式存在，但也有部分可溶蛋白表达。经SDS-PAGE凝胶电泳胶密度面积扫描分析得到MDH占全菌蛋白的63.0％，EGFP占全菌蛋白的49.7％，包涵体蛋白的产量分别为153.3 mg/(L培养液)和140.3mg/(L培养液)。
由于表达产物带有6个His Tag，因此利用固定化金属亲和色谱(Chelating SepharoseTM Fast Flow)对表达产物(MDH和EGFP)进行了亲和分离和复性的前期探索性实验。结果表明，固定化金属亲和色谱能够较好的吸附可溶性表达蛋白质和经脲变性的包涵体蛋白质，并可被洗脱缓冲液有效洗脱，得到了较好的分离纯化效果。