研究背景宫颈癌是严重威胁妇女健康的常见妇科肿瘤,在发展中国家居妇科恶性肿瘤的首位。虽然我国对宫颈癌的防治已取得很大成效,近年来随着人乳头状瘤病毒(HPV)感染率的上升和社会生活的变化,宫颈癌的发病率呈增高趋势,近20年来发病明显趋于年轻化,且宫颈腺癌比例增加。因为腺癌易早期发生淋巴结转移,对放疗的敏感性较差,对化疗容易产生耐药,因此治疗难度加大,预后不理想。因而寻找一种科学、可行的途径来增强放、化疗疗效,改善预后成为宫颈癌治疗领域研究的热点问题。糖原合成激酶-3(glycogen synthesis kinase-3,GSK-3)是一多功能丝氨酸/苏氨酸类激酶,广泛地分布在迄今研究过的所有真核生物中,在哺乳动物中包括两个亚型,即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β是糖原代谢过程中的重要限速酶,除了可以在胰岛素调控下磷酸化肝糖原合成酶(glycogen synthesis)并使之失活外,GSK-3β还在多个重要信号通路中扮演了关键角色,例如Wnt/β-catenin pathway,PI3K/AKT pathway,Hedgehog pathway,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动、细胞凋亡以及肿瘤发生等方面都扮演了重要角色。研究发现,GSK-3β与乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生密切相关,且在研究宫颈癌发病机理相关的多条信号转导通路中,我们发现GSK-3β是这些通路共同的交叉点,说明GSK-3β在宫颈癌的发生发展过程中起着重要的作用;但由于GSK-3β均不是研究的主要目的蛋白,而仅是被提及,且有关GSK-3β在宫颈癌发生过程中的作用机制的研究尚未见报道。因此,结合在其他恶性肿瘤中的研究,GSK-3β在新的抗肿瘤治疗中将成为一个颇具魅力的靶点。关于GSK-3β在宫颈癌中功能及作用机制的研究,将为探讨宫颈肿瘤发生、发展、转移、耐药机制提供一种新的思路与方法。研究目的观察GSK-3β表达及活性改变对宫颈癌演进、凋亡和对放、化疗敏感性的影响,并通过寻找其可能作用途径,探讨外源性改变GSK-3β活性或表达对宫颈癌放、化疗增敏的可能性,为以GSK-3β为靶基因治疗宫颈癌提供理论依据。研究方法1)采用免疫组织化学方法,检测GSK-3β在正常宫颈组织、宫颈癌前病变组织、宫颈恶性组织中的表达情况,分析其表达与临床分期、病理分级、组织学分型和转移的相关性;2)利用免疫细胞化学方法、RT-PCR、Western blot法检测Hela、Siha细胞中GSK-3β蛋白及其磷酸化蛋白的表达、定位情况;3) LiCl抑制GSK-3β活性后,MTT法检测Hela、Siha细胞耐药性的改变;4) Hoechst33342/PI染色检测LiCl抑制GSK-3β活性对顺铂诱导Hela、Siha细胞凋亡的影响;5)脂质体法将3种表达不同GSK-3β活性的质粒:pcDNA3/GSK-3β-S9A、pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-K85R转染宫颈癌Hela细胞株,Western blot检测转染效率、各转染细胞内GSK-3β的表达情况;6)免疫荧光法再次验证瞬时转染后各组细胞GSK-3β蛋白的表达、细胞内分布,结合倒置显微镜观察细胞表型的改变;7)流式细胞术对比分析各转染组细胞周期变化,透射电镜观察细胞超微结构变化;8)经过G418抗性筛选,获得稳定转染的Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R、Hela-Vec细胞株,MTT比色法绘制细胞生长曲线,观察GSK-3β蛋白对细胞增殖能力的影响;9)平板克隆形成实验、MTT法绘制细胞生长曲线,观察GSK-3β-S9A蛋白高表达对Hela细胞放疗敏感性的影响;MTT法检测6Gy X线照射后24、36、48、72和96h对Hela细胞生长的影响;10) Western blot检测不同剂量X线照射后,Hela细胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的诱导表达;11)通过MTT实验进行体外药物敏感性分析,计算Hela-S9A、Hela-WT、Hela- K85R、Hela-Vec及Hela细胞对顺铂的IC50值,分析GSK-3β-S9A蛋白高表达对Hela细胞顺铂敏感性的影响;MTT比色法检测5μg/ml顺铂作用后12、24、36、48和72h对Hela细胞生长的影响;12) Western blot检测5μg/ml顺铂作用48h后,Hela细胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的诱导表达;13) Western blot检测各组细胞内凋亡相关因子Bax和Bcl-2的表达及活性。研究结果1) GSK-3β蛋白是普遍存在的,随着从癌前病变发展至癌,GSK-3β蛋白表达量基本呈递减趋势,腺癌中的表达量明显降低(p<0.05);pGSK-3βSer9蛋白在病变组织的表达量均高于正常组织;2) Hela细胞中,GSK-3β主要定位于胞浆,胞核中几乎没有;而Siha细胞中,GSK-3β胞浆、胞核中均有表达;3) LiCl预处理Hela、Siha细胞6h,可明显增加其顺铂耐药性,且Hela细胞对顺铂耐药性更强;4) Hoechst33342/PI染色证明LiCl预处理Hela、Siha细胞6h可明显降低顺铂诱导的细胞凋亡的发生;5)细胞总蛋白提取物中,Hela、Siha细胞中总GSK-3β蛋白表达无明显差异,而Hela细胞,处于活性抑制状态的pGSK-3βSer9表达量明显低于Siha细胞,说明在Hela细胞中有更多有活性状态的GSK-3β;6)成功建立四组表达不同活性状态的pcDNA3.0/GSK-3β质粒稳定转染的细胞株Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R及阴性对照Hela-Vec细胞株,Western blot检测表明:各组细胞在GSK-3β蛋白分子量46KDa处均有明显蛋白表达条带,GSK-3β转染组细胞株中总GSK-3β蛋白水平均有明显升高;但各组的pGSK-3βSer9蛋白水平比阴性对照组有明显降低;7) GSK-3β-S9A转染可明显抑制Hela细胞的生长,并将细胞周期阻滞于G2-M期,从而阻碍DNA合成;透射电镜下观察也证实,细胞超微结构呈典型凋亡的形态学改变;8)免疫荧光法检测不同活性状态的GSK-3β质粒转染后GSK-3β蛋白定位情况。GSK-3β在正常的Hela细胞主要在胞浆表达,胞核中几乎没有;Hela-WT的细胞中,GSK-3β蛋白还是以胞浆表达为主,Hela-K85R细胞中,除了个别由于转染毒性凋亡的细胞,胞浆和胞核均有表达,以胞核表达较多,而导入GSK-3β-S9A突变体细胞中,GSK-3β几乎以胞核表达为主;9)不同剂量X线照射后,Hela-S9A细胞克隆形成率及细胞活力随着X线照射剂量的升高而下降,有较好的剂量-效应关系,细胞活力及存活率均明显低于未转染Hela细胞(p<0.01);6Gy X线照射后Hela-S9A细胞生长抑制率随时间延长显著增加,呈现良好的时间依赖关系,各时间点细胞生长抑制率明显高于未转染Hela细胞;10) Western blot检测结果提示:Hela-S9A细胞中GSK-3β蛋白表达水平随着X线照射剂量的升高而明显升高,有较好的剂量-效应关系;且同一剂量下,均比未转染Hela细胞明显增加;而β-catenin蛋白表达明显下降;11)各转染组细胞存活率均随顺铂药物浓度升高而下降;在同一药物浓度下,Hela-S9A细胞存活率明显下降,48h的IC50值为(0.38±0.02)μg/ml;5μg/ml顺铂作用后各组细胞生长抑制率随着时间的延长而显著增加,呈现良好的时间依赖关系;各检测点Hela-S9A细胞生长抑制率明显高于未转染Hela细胞;12) Western blot检测结果提示:Hela-S9A细胞GSK-3β蛋白表达水平随着顺铂作用时间的延长而明显升高,呈现良好的时间依赖关系;且同一剂量下,均比未转染Hela细胞明显增加;而β-catenin蛋白表达明显下降;13)在Wnt/β-catenin信号转导通路中,构成性激活GSK-3β即GSK-3β-S9A的高表达可诱导促凋亡基因Bax的高表达及抑凋亡基因Bcl-2的低表达,进而有助于抑制前体癌蛋白β-catenin表达。结论:在本实验条件下:1) GSK-3β在宫颈癌中呈低表达,且GSK-3β的表达随宫颈癌分期的升高而降低;2)胞核内pGSK-3βSer9表达减弱,是Hela细胞区别于Siha细胞的生物学特征之一;3) GSK-3β功能发挥与其细胞定位密切相关,LiCl通过引起细胞核内pGSK-3βSer9表达增强可提高Hela、Siha细胞对顺铂的耐药性;4)构成性激活GSK-3β可明显抑制细胞增殖,并增强X线放疗、顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强放、化疗对细胞的生长抑制,并具有较好的剂量-效应及时相性关系;5)在Wnt/β-catenin信号转导通路中,构成性激活GSK-3β的可通过诱导凋亡相关基因Bax和Bcl-2所介导的凋亡途径来抑制细胞生长及侵袭, GSK-3β起着关键的负性调控作用。