背景及目的妊娠期高血压疾病是指妊娠20周后出现以高血压、蛋白尿等为主要症状的一种疾病,该病可以引起多种并发症,如胎盘早剥、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)、HELLP综合征、肝肾功能衰竭、休克,甚至表现出多器官多系统障碍,严重时导致母婴的死亡。也可能对母亲导致远期心血管方面的并发症,如慢性高血压;还可引起胎儿急慢性宫内缺氧、胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)、治疗性早产(therapeutic preterm birth),严重时导致围产儿死亡;还可由于慢性缺氧导致胎儿的神经系统损伤以及远期并发症等。对孕妇和胎儿构成严重危害。子痫前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期高血压疾病的一个阶段。预测及预防高危人群将为临床早期防控,减少妊娠期高血压疾病并发症的发生,减少孕妇及胎儿风险有十分重要的意义。在全世界范围内,特别是在发展中国家,由于缺乏对PE明确的预测手段和处置方案,使其成为导致孕产妇死亡的第二大原因,也是导致围产儿发病及死亡的主要原因。近些年来,PE的研究一直是产科热点之一,但由于缺乏特异性标志物,且该病难以用单一病因解释,因此对PE的确切机制始终没有达成共识。PE的病因主要有以下学说:胎盘缺血、缺氧学说、氧化应激学说、炎症学说、免疫失衡学说及遗传因素等。其中胎盘缺血缺氧导致的浅着床是目前比较公认的学说之一。该理论最著名的为“两阶段”学说,即在早孕期胎盘的滋养细胞侵袭障碍、滋养细胞重铸障碍,中晚期由于胎盘缺血缺氧,释放多种的炎性因子等物质进入母体血液循环,导致血管内皮损伤和全身系统性炎症反应。在两阶段学说基础上,发展形成的“三阶段”病因学说认为,胎盘源性不良因子的释放是PE发生的关键环节,在这过程中,滋养细胞侵袭能力下降致胎盘浅着床,胎盘血管重塑障碍是PE发生的中心环节。目前,研究认为引起滋养细胞侵袭能力下降的原因的较多,如:低氧,一些蛋白和细胞因子等。参与滋养细胞侵袭力调节的许多因素中,低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是滋养细胞侵袭力调节的重要因素。HIF是由α、β两个亚基组成的异二聚体结构,其中α亚基是功能和活性亚基,受缺氧的调节,决定着HIF的活性。β亚基则稳定表达。研究证实,HIF-1α对于低氧条件下,胎盘的血管构建有拮抗作用。研究证实,双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)超家族的一个亚家族,是HIF-1α的负性调控因子。DUSPs在人体细胞内广泛存在,参与多种细胞内信息传递过程,介导细胞生长、发育、分化及凋亡全过程,以及肿瘤的形成。在肝癌细胞的研究中发现,DUSP1可通过钝化ERK/MAKP的活性保护HIF-1α的过度激活,从而调节细胞凋亡。研究也显示,DUSP1通过ERK/MAPK通路对HIF-1α发挥作用。在ERK/MAPK通路中,最重要的信号分子就是磷酸化的ERK1/2。DUSPs在机体中有着十分广泛的作用,目前有研究表明,DUSP9,DUSP5在PE中低表达。基于以上认识,本研究首先选择临床标本进行检测,观察DUSP1及HIF-1α蛋白在早孕绒毛及静脉血中的水平,以及不同孕周足月孕及重度子痫前期组(severe pre-eclampsia,s PE)患者胎盘及静脉血中的表达,通过体外试验,对Be Wo滋养细胞株进行低氧培养,模拟PE的状态,研究DUSP1与HIF-1α蛋白及m RNA表达之间的关系,通过Be Wo细胞中DUSP1过表达及基因沉默,研究在改变DUSP1的表达对HIF-1α表达的影响,以及DUSP1基因表达改变对滋养细胞侵袭及增殖功能的影响,探讨DUSP1对HIF-1α的调控作用。本研究的完成为PE的早期诊断提供新的思路;为深入了解DUSP1在PE发生机制中的作用阐明其分子理论。材料与方法第一部分:临床研究部分。临床分组:选择2013年1月至2014年5月,在我院诊治的孕妇,共分为三组:(1)正常早孕组,选择孕5~10周的自愿终止妊娠的孕妇,共94例。(2)正常足月妊娠组,选择妊娠37周至42周孕妇,共90例。(3)s PE组,在我院产科确诊为s PE的患者并排除以下疾病者:肾病、糖尿病、哮喘、肝炎等疾病史的患者,共70例。所有早孕组患者收集绒毛及静脉血,所有足月妊娠及s PE组患者均收集胎盘组织、静脉血及脐血标本。同时记录所有患者的年龄、孕产次、文化程度、孕周、新生儿出生情况(如Apgar评分、体重及身长)。检测DUSP1及HIF-1α蛋白及m RNA含量及表达变化。检测方法:利用W.B及免疫组化检测胎盘组织中的蛋白变化;利用ELISA方法了解静脉血中的蛋白浓度变化情况;利用Q-PCR检测组织中m RNA的表达情况。将上述结果进行多因素分析,探讨与PE的关系。第二部分:检测在常氧和低氧时,Be Wo滋养细胞株DUSP1及HIF-1α蛋白及m RNA的表达变化、增殖力和侵袭力的变化,了解DUSP1及HIF-1α与滋养细胞功能之间的关系。实验分组:常氧组:指在氧浓度为20%条件下培养Be Wo滋养细胞。低氧组:指在1%氧浓度情况下培养Be Wo滋养细胞。分别取常氧组和低氧组不同培养时间(24h、36h、48h、60h、72h)的Be Wo滋养细胞进行如下检测:利用W.B对DUSP1及HIF-1α蛋白表达进行检测,利用Q-PCR对DUSP1及HIF-1αm RNA表达进行检测,利用CCK8对进行细胞增殖力检测,利用Transwell进行细胞侵袭力的检测。第三部分:观察改变DUSP1的表达对Be Wo滋养细胞株HIF-1α表达、细胞侵袭及增殖力的影响。方法:构建DUSP1过表达载体及基因沉默载体,分别转染Be Wo滋养细胞株,检测磷酸化ERK及HIF-1α蛋白及m RNA的表达变化以及Be Wo滋养细胞侵袭力和增殖能力的变化。蛋白含量检测、m RNA检测、侵袭力及增殖力检测的方法同第二部分。结果:1、对临床病例检测DUSP1及HIF-1α表达结果显示,s PE组胎盘组织及静脉血中DUSP1蛋白及m RNA表达明显低于足月孕组,s PE组胎盘组织及静脉血HIF-1α含量明显高于足月孕组。各组结果如下:(1)ELISA检测早孕组绒毛、足月孕组及s PE组的胎盘组织中DUSP1浓度分别为:824.22±236.17,1058.43±266.23及774.12±144.76pg/ml,其中s PE组胎盘组织中DUSP1浓度明显低于正常足月孕胎盘中的浓度。在早孕组绒毛组织、足月孕及s PE组胎盘组织中HIF-1α蛋白浓度分别为264.42±66.23、155.25±36.60及314.42±44.76 pg/ml。s PE胎盘组织中HIF-1α蛋白浓度明显高于正常足月孕胎盘中的含量。三组静脉血中DUSP1浓度分别为:222.58±101.26,237.62±86.72,214.03±108.54 pg/ml。s PE组静脉血中DUSP1浓度明显低于足月孕组。静脉血中的HIF-1α蛋白含量分别为:20.60±7.80,17.05±4.26,27.86±5.54 pg/ml,正常早孕及s PE患者静脉血中HIF-1α蛋白浓度升高,足月孕时明显降低。(2)利用W.B进行DUSP1及HIF-1α蛋白表达的检测,DUSP1相对(a-TUBLIN)灰度平均值在早孕组绒毛、足月孕组及s PE组胎盘中分别为0.1299±0.036,0.5256±0.187及0.1378±0.069。利用灰度值比较,早孕组绒毛及s PE组胎盘中较正常足月孕组的胎盘中DUSP1明显降低。早孕组绒毛、足月孕组及s PE组胎盘中HIF-1α相对灰度分别为为1.5±0.34,0.6±0.22,1.9±0.42。利用相对灰度值比较,HIF-1α蛋白在早孕组绒毛及s PE组胎盘中明显高于足月孕组胎盘中的表达。(3)利用Q-PCR对DUSP1 m RNA表达进行检测,早孕组绒毛、足月孕及s PE组胎盘各组相对浓度值结果分别为:0.0263±0.0082、0.3535±0.0142、0.0062±0.0018,足月孕组胎盘中的DUSP1 m RNA较早孕组绒毛及s PE组胎盘中的明显升高。Q-PCR检测HIF-1αm RNA表达结果为:早孕组绒毛、足月孕及s PE组胎盘各组相对浓度值结果分别为:0.326±0.036,0.239±0.038、0.445±0.052,s PE组胎盘中的结果高于正常足月孕组胎盘中的表达。(4)利用免疫组化对DUSP1及HIF-1α蛋白进行检测,对DUSP1蛋白的定位,在滋养细胞的胞膜中及胞核中表达明显,s PE组胎盘中的表达明显低于正常足月孕组。胎盘组织中HIF-1α的阳性表达主要分布于胎盘滋养细胞的胞核或胞浆内可见深棕色或淡黄色颗粒,s PE组HIF-1α蛋白阳性着色细胞数明显高于正常足月孕组。2、在低氧及常氧条件培养不同时间后的Be Wo细胞中,分别在培养24h,36h,48h,60h,72h时,检测DUSP1蛋白及m RNA水平,发现低氧组较常氧培养时降低,而且随着低氧时间延长,DUSP1的表达进一步下降,在培养48h后,这种差异更明显。在低氧培养的Be Wo细胞中HIF-1α蛋白及m RNA表达较常氧组升高,随着低氧时间延长,HIF-1α蛋白及m RNA表达均进一步升高,在培养48h后,两种蛋白的表达在常氧组及低氧组有明显差异。Transwell检测发现低氧培养的Be Wo滋养细胞的侵袭力较常氧时明显减弱,CCK8检测发现,低氧培养时,滋养细胞增殖力有增强的趋势。3、在DUSP1过表达Be Wo细胞,P-ERK及HIF-1α蛋白及m RNA的表达量均降低,Transwell检测发现该细胞侵袭力增强,CCK8检测其增殖力减弱;而在DUSP1基因沉默载体转染后的Be Wo细胞中,P-ERK及HIF-1α表达均升高。Transwell检测发现该细胞的侵袭力减弱,CCK8检测发现其增殖力增强。结论1、DUSP1蛋白及m RNA在s PE组胎盘组织中的表达明显低于正常足月孕组,HIF-1α蛋白及m RNA的表达在s PE组胎盘中明显高于正常足月孕组,提示DUSP1及HIF-1α与s PE的胎盘异常发育过程有一定的相关。2、常氧条件培养的Be Wo细胞中,DUSP1及HIF-1α蛋白及m RNA表达较恒定,1%氧浓度时,DUSP1表达明显降低,HIF-1α表达升高,滋养细胞侵袭力下降,表明氧浓度的变化可能是导致PE胎盘浅着床的关键环节之一,提示调节氧浓度,改变局部氧状况,有望阻止PE的发生。3、利用DUSP1浓度调控后的Be Wo细胞株,研究发现DUSP1降低的Be Wo细胞中,磷酸化ERK和HIF-1α蛋白及m RNA表达明显上升,细胞的侵袭力降低。提示DUSP1浓度的变化影响滋养细胞侵袭力可能是PE胎盘浅着床的环节之一。因此,推断DUSP1的表达变化,可能是通过磷酸化ERK和HIF-1α蛋白调控对PE产生影响。