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阿嗪霉素B(Azinomycin B)又叫嗜癌霉素A,是1954年由日本科学家从Streptomyces sahachiroi的发酵产物中分离得到的一种有良好的体内抗肿瘤活性和潜在的体外细胞毒活性的天然化合物。后来又从另外一种链霉菌Streptomyces griseofuscus的发酵产物中也分离得到了Azinomycin B的其它结构类似物(Azinomycins),Azinomycins的结构非常独特,含有一个奈甲酸单元,一个环氧丙烷结构,还有现知化合物中独一无二的氮杂双环(1-azabicyclo[3.1.0]-hexane ring)结构。其中Azinomycin B的活性最好,抗肿瘤活性与临床应用的丝裂霉素相当。机理是通过环氧丙烷和氮丙啶烷基化DNA的嘌呤碱基,形成链间交联,从而起到抑制细胞增殖的作用。Azinomycin B结构的不稳定性,限制了其开发利用,利用化学方法改造其结构成本高昂,组合生物合成的方法可以高效低成本的产生活性更好,结构更稳定的Azinomycin B的类似物。利用Ⅰ型重复使用聚酮合成酶(iterative typeⅠpolyketides, iPKS)的保守序列,设计兼并性引物,PCR扩增到Ⅰ型重复使用聚酮合成酶的DNA片段,并以之为探针筛选Azinomycin B的产生菌Streptomyces sahachiroi NRR2485的Cosmid基因组文库,克隆到了基因组上约60kb的DNA序列,生物信息学分析显示其为Azinomycin B的生物合成基因簇,包含39个开放阅读框。通过在异源宿主Streptomyces albus中单独表达aziB,得到产物5-甲基萘甲酸,共表达aziB,aziB1,aziB2得到产物3-甲氧基-5-甲基萘甲酸,从而证明了克隆的DNA序列包含Azinomycin B的生物合成基因簇。通过同源重组的方法对ORF 36进行了基因中断后,还能检测到Azinomycin B的产生。从而确定了Azinomycin B的生物合成基因簇的边界。氯丝菌素(Chlorothricin,CHL)是一个产生于S.antibioticus DSM40725的螺环乙酰乙酸内酯家族抗生素,该家族天然产物具有广泛生物活性(包括抗感染、抗肿瘤、抗疟和胆固醇合成抑制等),以Ⅰ型聚酮合成酶基因片段作为探针,结合染色体步移的方法克隆了S.antibioticus DSM 40725染色体上122 kb左右的完整CHL生物合成基因簇。发现在其中chlBl编码的是一个Ⅰ型重复使用聚酮合成酶。Azinomycin B生物合成基因簇中的aziB编码的也是一个Ⅰ型重复使用聚酮合成酶。ChlB1和AziB1组织结构相同,蛋白序列同源性高,但是ChlB1催化合成单环芳香化合物6-甲基水杨酸,而AziB催化合成双环的5-甲基萘甲酸。以ChlB1和AziB为对象研究Ⅰ型重复使用聚酮合成酶的催化机制,对ChlB1和AziB的脱水功能域(DH domain),酮基还原功能域(KR domain)的特异性位点突变,结果AziB的DH,KR的突变体中没有检测到可能的中间体,而在ChlB1的947的H突变成F的DH突变体,检测到6-甲基水杨酸,1540位的Y突变成F后的KR突变体产生了苔色酸(OSA),说明在Ⅰ型重复使用聚酮合成酶的催化过程中DH的功能是重要的但不是必须的,KR的功能的缺失并不影响其进一步的延伸反应。通过对Azinomycin B生物合成基因簇中p450羟化酶AziB1,氧甲基转移酶AziB2,非核糖体聚肽合成酶(NRPS) AziAl的体外测活研究,证明了AziB1催化的是Ⅰ型重复使用聚酮合成酶的产物5-甲基萘甲酸C-3位置的羟化,AziB2催化的是接下来氧甲基化,最后有AziA1识别3-甲氧基-5-甲基萘甲酸并以之为起始单元,起始Azinomycin B的生物合成,证明了Ⅰ型重复使用聚酮合成酶AziB产物的后修饰是发生在游离小分水平上的,而不是发生在酰基载体蛋白(ACP)连接的蛋白水平上的。氯丝菌素具有较好的抗菌和抗肿瘤活性,在前期的研究中发现的其Ⅰ型重复使用聚酮合成酶ChlB1产物6-甲基水杨酸的后修饰是发生在ACP连接小分子的蛋白水平上的,在这个过程中,两个酰基转运蛋白(AT) ChlB3, ChlB6的底物容忍性相对宽泛,而且在对ChlB1这一Ⅰ型重复使用聚酮合成酶的机制研究的过程中,通过点突变KR结构域的方法成功的把ChlB1这一六甲基水杨酸合成酶(6-MSAS)改造成了苔色酸合成酶(OSAS),在这些基础上,把ChlB1遗传改造来的OSAS,导入到Chlorothricin产生菌S.antibioticus DSM40725的chlB1中断的突变菌株中,得到的新的重组菌株产生了新的Chlorothricin类似物7和8,7和8显示出更高的抗菌活性。从而完成了从生物合成机制的基础研究到组合生物合成利用的一个经典过程。