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背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤之一,在全球范围内,其发病率在恶性肿瘤中居第六位,死亡率居第二位。我国是肝病高发地区,据统计,我国HCC的发病人数和死亡人数均占全球的50%左右,严重影响国人的生命健康。HCC的治疗是以手术切除为主的综合治疗,但HCC患者术后5年的复发转移率高达70%。HCC的高侵袭转移特性是患者术后复发转移的重要因素。研究发现上皮-间质转分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤侵袭转移的重要机制。EMT是指上皮细胞经特定的转化程序失去其上皮特性并向具有运动特性的间质细胞转化的生物学过程。在该过程中,上皮特性的肿瘤细胞间及细胞与基底膜间的粘附消失,失去上皮细胞极性,肿瘤细胞发生形态改变,并获得运动能力。目前已证实EMT在HCC的侵袭转移过程中扮演了十分重要的角色。HCC细胞经EMT获得运动能力,伸出侵袭性伪足,从原发灶脱离并侵蚀周围组织血管,经血液运输在远处定居,形成转移癌灶。细胞骨架是细胞的重要成分,其在维持细胞的形态、运动及功能方面具有重要作用。肌动蛋白是细胞骨架的重要成分之一,其形态结构的改变与EMT的发生紧密关联。在EMT过程中,各种诱导因子通过特定信号通路产生刺激作用,使肌动蛋白细胞骨架相关蛋白的表达发生变化。肌动蛋白相关蛋白的表达变化可打破肌动蛋白细胞骨架的动态平衡,使肌动蛋白细胞骨架的解聚与重组严重失衡,导致细胞形态改变及伪足形成。研究证实肌动蛋白细胞骨架动态装配的变化在侵袭性伪足的形成中发挥重要作用。戴帽蛋白(Capping protein,Cap Z)是一种肌动蛋白结合蛋白,可结合在肌动蛋白丝的正极,阻止球状肌动蛋白结合至纤维肌动蛋白丝上,抑制肌动蛋白细胞骨架在正极方向上的延长。因此,Cap Z被认为在调节肌动蛋白细胞骨架的重塑中发挥了重要作用。CAPZA1是Cap Z的α1亚基。因此,在理论上我们可以推测:CAPZA1可通过调控肌动蛋白细胞骨架的重塑抑制肿瘤的EMT,从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。研究报道,CAPZA1与神经母细胞瘤及胃癌的侵袭转移有关,但其机制尚不清楚。CAPZA1是否参与了HCC的侵袭转移过程,目前亦未见文献报道。目的1.收集HCC病例,检测癌组织石蜡标本中CAPZA1的表达,分析HCC癌组织中CAPZA1的表达与HCC的TNM分期、病理分化、血管侵犯、周围淋巴结转移、肝外转移及患者预后的关系,初步明确CAPZA1是否参与HCC侵袭转移的过程。2.在细胞水平上,验证CAPZA1在HCC细胞侵袭转移过程中的抑制作用,明确CAPZA1与肝癌细胞EMT的负向调控关系,并初步研究CAPZA1抑制肝癌细胞EMT的分子机制。3.构建裸鼠肝脏原位移植癌模型,在活体内观察CAPZA1对HCC细胞侵袭转移的影响。方法1.经第三军医大学第一附属医院伦理委员会审批,我们收集了2011年1月至2011年12月在我院行HCC手术切除的病例129例,其中男性115例,女性14例。查阅患者病历记录,总结HCC的大小、病理分化、TNM分期、血管侵犯、周围淋巴结转移及肝外转移等临床病理信息。并对患者进行随访,随访至2015年12月31日,记录HCC患者复发及死亡情况。免疫组化检测129例HCC癌组织石蜡标本中CAPZA1的表达,分析CAPZA1的表达与HCC的临床病理和患者预后的关系。2.体外培养Hep G2及MHCC97H细胞,对侵袭能力较弱的Hep G2细胞CAPZA1的表达进行干扰,对侵袭能力较强的MHCC97H细胞CAPZA1的表达进行上调。CCK-8检测Hep G2和MHCC97H细胞的增殖能力。Transwell迁移和侵袭实验分别检测Hep G2和MHCC97H细胞的迁移和侵袭能力。Western blot、q PCR检测Hep G2和MHCC97H细胞中CAPZA1及EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达。免疫共沉淀检测CAPZA1与actin的相互作用。Western blot检测EMT相关转录因子Snail家族、ZEB家族和Twist家族的表达变化情况。3.体外构建CAPZA1稳定低表达的Hep G2细胞和稳定高表达的MHCC97H细胞,分别将上述细胞注射入裸鼠肝脏包膜下,建立裸鼠肝脏原位移植癌模型。6周后用小动物MRI观察肿瘤细胞在裸鼠肝脏内的侵袭转移,并统计裸鼠的死亡情况。结果1.在HCC的TNM分期中,CAPZA1低表达组在Ⅲ-Ⅳ期的比率明显高于CAPZA1高表达组(P<0.001);在HCC病理分化中,CAPZA1低表达组的HCC癌组织分化程度低于CAPZA1高表达组(P<0.001);与CAPZA1高表达组相比,CAPZA1低表达组不但具有较高淋巴组织侵犯率(P=0.033)和血管侵犯率(P=0.002),而且其肝外转移率也明显较高(P=0.006)。此外,CAPZA1低表达组患者术后5年复发率和死亡率明显高于CAPZA1高表达组(P<0.001)。2.干扰CAPZA1的表达可促进Hep G2的迁移和侵袭,上调CAPZA1的表达可抑制MHCC97H的迁移和侵袭。CAPZA1的表达变化对Hep G2和MHCC97H细胞的增殖无影响。CAPZA1的表达下调后,上皮细胞标志物E-cadherin表达下降,间质细胞标志物N-cadherin和vimentin的表达上调;CAPZA1表达上调后,上皮细胞标志物E-cadherin表达上调,间质细胞标志物N-cadherin和vimentin的表达下降。CAPZA1与actin可发生相互作用。当CAPZA1的表达下调时,转录因子Snail1和ZEB1的表达升高;CAPZA1的表达上调时,转录因子Snail1和ZEB1的表达下降。3.CAPZA1稳定低表达的Hep G2细胞与对照组相比,其在裸鼠肝脏内发生了广泛的侵袭转移,且裸鼠的生存时间较短。CAPZA1稳定高表达的MHCC97H细胞与对照组相比,其在裸鼠肝内的侵袭转移明显被抑制,其裸鼠的生存时间较长。结论1.CAPZA1与HCC的TNM分期、病理分化、血管侵犯、周围淋巴结转移、肝外转移及患者预后呈负相关,CAPZA1可作为判断HCC预后的肿瘤标志物之一。2.CAPZA1可通过调控肌动蛋白细胞骨架的重塑来抑制HCC细胞的EMT,从而降低HCC的侵袭转移能力。转录因子Snail1和ZEB1参与了CAPZA1抑制HCC EMT的过程。3.在活体内,CAPZA1可抑制裸鼠肝脏原位移植癌的侵袭转移。通过对临床病例、细胞实验和动物实验三方面的研究,我们明确了CAPZA1在HCC侵袭转移过程中的作用,并初步得出如下结论:CAPZA1可通过调控肌动蛋白细胞骨架的重塑来抑制HCC细胞的EMT,从而降低HCC的侵袭转移能力。CAPZA1可作为临床上用于判断HCC患者预后的肿瘤标志物。但CAPZA1是如何通过调控肌动蛋白细胞骨架重塑来抑制HCC细胞的EMT过程,我们缺乏深入研究。这将是我们后续研究工作中的重点任务。