健康的牙周组织是正常牙齿发挥功能的保障,而牙周炎的发生往往导致牙周组织的渐进性破坏,如未得到及时治疗,最终造成牙齿松动脱落,现已成为我国成年人牙齿缺失的首要原因。不仅如此,已有研究证实牙周炎与全身多系统的发病率具有相关性如心脑血管疾病、低体重早产儿、糖尿病等。因此牙周炎的防治逐渐成为人们关注的话题。众所周知,牙周炎是一种以菌斑为始动因素的多因素疾病,目前临床上治疗牙周炎的方法主要以控制菌斑为主,主要包括洁治术、刮治术、翻瓣术等,能够有效延缓/控制牙周炎的发生,但临床上有时会发现这样的现象:口腔卫生较差的患者,其牙周炎的病变程度较轻,而口腔卫生较好的患者可能伴有严重的牙周病损。同样临床表征的患者采用同种治疗方法后,患者的疾病预后也不尽相同。为了解释这些现象,有研究发现饮食、吸烟、口腔环境、细菌等因素可以通过影响宿主参与炎症反应的基因,从而影响口腔健康。而近年来发现这些因素皆与表观遗传具有相关性。表观遗传是与遗传相对提出的,是指DNA序列不发生变化,而基因表达发生了可遗传性变化,此种变化是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质的改变,且在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及染色体重塑等多种形式,其中DNA甲基化和组蛋白修饰是表观遗传的两种主要方式。表观遗传修饰渗透了人类健康与疾病的全部领域。表观遗传修饰,在功能上,是基因组适应环境变化的一种有效手段;在机制上,是通过各种不影响DNA序列的方法对基因表达进行调控;由于生物总是要对环境的各种变化进行适应,而同时要竭力维持遗传序列的稳定性,这就使得表观遗传修饰几乎每时每刻都在发生着变化,表观遗传的发生主要由表观遗传学酶来调控。现有研究表明,表观遗传与肿瘤、心血管疾病、神经退行性变及类风湿性关节炎等疾病的发生发展密切相关。那么,在牙周炎的发生过程中表观遗传是否参与其中,有哪些表观遗传学酶发生了变化,哪些表观遗传学酶可能为关键酶,这些酶又是如何影响细胞的生物学性能从而影响牙周健康的,有待进一步的探索,这对于牙周病的诊治和识别患者的患病风险具有潜在意义。目的通过分离培养同一患者来源的炎症牙周膜干细胞(inflamed periodontal ligament stem cells,i-PDLSCs)和正常牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),以PDLSCs为对照,筛选i-PDLSCs中变化明显的表观遗传学酶,并验证目标酶对牙周膜干细胞增殖能力的影响,为表观遗传与牙周炎的相关性提供理论依据。方法1.炎性牙周膜干细胞(i-PDLSCs)和正常牙周膜干细胞(PDLSCs)的分离、纯化培养和鉴定我们选取同一患者因牙周炎而拔除的无功能牙和因阻生而拔除的新鲜健康第三磨牙,采用酶消化与组织块联合法分别分离培养原代正常和炎症牙周膜细胞;采用有限稀释法纯化i-PDLSCs和PDLSCs;使用流式细胞仪对分离纯化出的两种细胞的干细胞相关表面标记物进行检测及鉴定;采用MTT及克隆形成方法检测两种细胞增殖能力;采用成骨、成脂诱导实验对两种细胞的多向分化潜能进行检测。2.牙周炎相关表观遗传学酶的筛选通过文献查阅获得已有相关报道的表观遗传各家族酶共72个(附表1)。通过将同一患者来源的i-PDLSCs和PDLSCs对比,筛选牙周炎过程中变化明显的表观遗传学酶,首先分别收集两种细胞,提取两种细胞总RNA,通过实时定量PCR进行筛选,以PDLSCs为对照组,确定i-PDLSCs中变化较为明显的表观遗传学酶。为进一步验证所筛选的结果,利用TNF-α对PDLSCs进行炎性刺激以模拟炎性环境,收集正常组与炎性诱导组细胞,提取总RNA后通过RT-PCR筛选两组中变化较为明显的表观遗传学酶。根据体内炎性环境直接来源的i-PDLSCs及体外炎性刺激来源的i-PDLSCs所筛选的两组结果,确定牙周炎相关表观遗传学酶。3.KAT2A对牙周膜干细胞增殖能力的影响根据实验二的筛选结果及相关文献报道,我们选定KAT2A为本实验的目标表观遗传学酶,并对其进行功能验证。为探寻表观遗传学酶对牙周膜干细胞的影响,我们首先通过蛋白免疫印迹法(WB)验证所筛选出的目标酶KAT2A在i-PDLSCs和PDLSCs中的表达情况;然后利用KAT2A si-RNA对PDLSCs进行目标酶表达沉默,通过RT-PCR及WB进行沉默效能检测;成功沉默后,对沉默前后两组细胞的增殖能力采用MTT法、克隆形成、流式细胞仪检测细胞周期法以及RT-PCR检测细胞周期相关基因CCD1、CCE1及E2F1的表达情况进行检测。4.统计学分析所有数据使分别用SPSS19.0和Graph Pad Prism5进行统计和作图分析处理,计量资料以均数±标准差(X±SD)形式表示,两两比较采用t检验,以P<0.05为有统计学意义。结果1.本实验共取材12例,其中i-PDLSCs培养成功8例,PDLSCs培养成功10例,共同培养成功7例。3-7 d显微镜下可以观察到贴壁细胞,细胞形态呈梭形,集落样生长。有限稀释法挑选单细胞克隆,扩大培养后获得两种高纯度干细胞。流式细胞检测结果显示两种细胞均阳性表达CD146、CD105,阴性表达造血干细胞标记CD45和内皮干细胞表面标记CD31。MTT检测发现两种细胞均具有较强的增殖能力,但i-PDLSCs的增殖能力明显。茜素红染色后两种细胞均可以观察到矿化结节,油红O染色后镜下均可以观察到脂滴。证明我们所分离、纯化培养的两种细胞为高纯度的人牙周膜干细胞。2.分别提取同一患者来源i-PDLSCs和PDLSCs两种细胞总RNA,通过RT-PCR观察两种细胞中表观遗传学酶表达情况,结果显示表观遗传学酶在i-PDLSCs和PDLSCs两组中表达并不一致,这与我们预期的情况是相符的。根据原始筛选结果中组蛋白乙酰化转移酶家族的变化情况以及以往研究,我们确定组蛋白乙酰化转移酶为重点筛查家族。RT-PCR筛查结果显示多数组蛋白乙酰化转移酶在i-PDLSCs组中表达较PDLSCs低。分析总结各组样本RT-PCR筛查结果发现:多数组蛋白乙酰化转移酶(KAT2A、ELP3、HAT1、KAT6A和KAT6B)在i-PDLSCs组中表达较PDLSCs组低,少数组蛋白乙酰化转移酶(NCOA3和GTF3C4)在i-PDLSCs中表达较PDLSCs组高。进一步利用TNF-α炎性因子体外模拟炎性环境对PDLSCs进行炎性刺激,收集正常组与炎性刺激组细胞,提取总RNA,通过RT-PCR筛选两组中变化较为明显的表观遗传学酶。筛选结果与上述结果基本一致,即多数组蛋白乙酰化转移酶在炎性环境下表达呈下降趋势。分析总结以上结果发现,与正常组相比,KAT2A、KAT6A和KAT6B的表达在炎症组及炎性刺激组中表达降低。3.根据实验二的筛选结果及相关文献报道,我们选定KAT2A为本实验的目标表观遗传学酶,并对其功能进行验证。使用si-RNA沉默PDLSCs中KAT2A的表达,RT-PCR及WB检测显示,沉默效率达到50%,说明我们在PDLSCs中成功沉默了KAT2A。KAT2A沉默后,其克隆集落形成能力、增殖能力均较沉默前明显下降(P<0.05)。流式细胞周期检测发现,沉默KAT2A后,S期细胞明显下降,多数阻滞于G1期。另外,RT-PCR检测发现,,KAT2A沉默后细胞周期素CCD1、CCE1及E2F1表达量较沉默前也均有所降低。结论1.正常来源与炎性来源牙周膜干细胞均可成功分离,纯化培养后,经流式检测、MTT检测、克隆形成实验、成脂及成骨诱导分化确定,两者均符合间充质干细胞特性。2.炎性微环境影响了PDLSCs中表观遗传学酶的变化,其中KAT2A、KAT6A和KAT6B为牙周炎过程中变化显著的表观遗传学酶。3.组蛋白乙酰化转移酶KAT2A与细胞增殖能力具有相关性,si-RNA沉默KAT2A后PDLSCs增殖能力下降。