背景：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)，是以运动神经元渐进性变性为主的慢性进展性的神经变性疾病，最终导致瘫痪和死亡。ALS一个明显特点是：在运动神经元（MNs）的细胞内有蛋白质和损伤线粒体的聚集体，包括SOD1和TDP-43等。这说明在ALS患者的MNs不能有效的清除蛋白质和细胞器。因此，对于蛋白质聚集通路的研究能够帮助我们进一步理解ALS的病理变化。SOD1基因编码胞浆铜、锌SOD酶，是首个发现的导致ALS的基因。突变的SOD1通过获得的毒性导致运动神经元的损伤。SOD1突变的小鼠主要表现为运动神经元的变性，这个ALS的动物模型能够模拟许多人类ALS疾病的特征。在MNs中，SOD1被认为是ALS相关包涵体的最新奇元件。研究表明突变的SOD1与动力蛋白相连改变了它的位置，并且抑制自噬体与溶酶体正常的融合。最近的研究显示增加突变SOD1的自噬清除率能延迟ALS中MNs的丢失，暗示对于ALS疾病应积极的影响自噬。在体外，通过雷帕霉素诱导自噬也显示SOD1聚集体和SOD1介导的毒性的减少。因此，存在这种可能，即突变的SOD1与自噬的调节分子相互关联促进神经变性，反之自噬对SOD1聚集体的清除有利于MNs的存活。由TARDBP基因编码的TDP-43蛋白主要分布于胞核，它的功能主要涉及剪切和转录的调节。最近的研究表明突变的TDP-43可产生神经元的毒性，而受累的细胞内可发现有TDP-43蛋白聚集体。与ALS相关的突变的TDP-43可被截断，从而产生两个C末端的片段：一个25KD,一个35KD，这两个C末端的片段具有细胞毒性。我们发现由TARDBP基因编码的TDP-43蛋白的突变导致遗传性泛素阳性的额颞叶退化和ALS疾病，这也表明TDP-43聚集体与ALS发病机制有关。而且，自噬抑制剂3-MA能减少自噬的水平，增加了细胞内TDP3的聚集体。相反的雷帕霉素诱导的自噬能够减少TDP-43的聚集体以及恢复它的核定位，这些导致细胞中mRNA过程缺陷的减少。而且，通过由海藻糖诱导的mTOR依赖的通路增加自噬的水平也可以减少TDP-43的聚集体。由于神经元不能通过有丝分裂进行增殖，所以毒性聚集蛋白的清除对于神经元细胞的存活是至关重要的。在真核细胞中主要存在两种清除蛋白的通路：一种是蛋白酶体通路（UPS），一种是自噬通路。UPS对于短寿命蛋白的降解具有高度的选择性，但是自噬作为一个补充的通路，可以降解长寿命的胞浆蛋白和细胞器。不论是UPS还是自噬的功能障碍均可致ALS相关蛋白的聚集，但是最近的研究表明自噬通路对于MNs的存活更加重要。对ALS病人和动物模型的尸检研究表明：在脊髓的运动神经元中自噬的标志物水平是升高的。在亨廷顿病（HD）和其它神经变性疾病中诱导自噬可减少异常的蛋白聚集物和减缓疾病的恶化。这些研究都表明自噬通路在ALS发病机制中的重要作用。Alfy (Autophagy linked FYVE protein)是一个400KD的蛋白，包含一个BEACH结构域，WD-40结构域和一个与3磷脂酰肌醇（PI3P）结合的FYVE结构域。Alfy在哺乳动物组织中普遍存在，脑中含量最多。在正常情况下主要分布于细胞的核和核膜，在应激状态，可被募集到细胞胞浆泛素阳性蛋白聚集体。最近的研究表明缺乏与Alfy同源的bchs的果蝇虽然可以成熟并具有生育能力，但是由于泛素阳性包涵体的聚集和神经元的变性，它们的寿命比健康的果蝇短。在一个主要的神经元HD模型和多聚谷氨酸毒性的果蝇眼模型中，依赖自噬方式，过表达Alfy（或bchs）能减少蛋白包涵体和保护细胞免受增多的多聚谷氨酸的毒性。而目前尚无ALS动物模型中Alfy分布及表达变化的研究,也无Alfy对ALS相关致病蛋白表达影响的报道。第一部分ALS动物模型中Alfy的分布及表达变化目的：本研究的目的是研究不同时期SOD1-G93A转基因小鼠中Alfy的分布及表达变化，并检测Alfy是否与突变的SOD1共定位。以探讨Alfy在体内细胞的分布特点。方法：本研究应用SOD1-G93A转基因和非转基因同窝对照的小鼠，转基因小鼠的鉴定通过PCR扩增的方法。选择不同时期的SOD1-G93A转基因小鼠（症状前期、症状早期和终末期）和非转基因小鼠的腰髓，用免疫组化和免疫荧光的方法观察Alfy蛋白的分布及表达变化。采用real-time PCR方法观察不同时期转基因小鼠中Alfy在mRNA水平上的表达变化。结果：（1）应用免疫组化和免疫荧光的方法，通过对非转基因小鼠腰髓的切片进行观察，在正常小鼠脊髓，Alfy主要分布于神经元的核中。在正常小鼠脊髓的星形胶质细胞和小胶质细胞中未见明显的Alfy蛋白的表达。（2）应用激光共聚焦显微镜观察SOD1-G93A转基因小鼠的腰髓切片表明，症状早期和终末期小鼠神经元细胞中的Alfy由胞核向胞浆移动。（3）应用激光共聚焦显微镜观察SOD1-G93A转基因小鼠的腰髓切片表明，SOD1-G93A转基因鼠的神经元细胞中Alfy由核被募集到胞浆并能与胞浆中突变的SOD1共定位。在SOD1-G93A转基因鼠活化增生的星形胶质细胞中可以观察到明显的Alfy的表达。（4）采用real-time PCR方法，研究结果表明不同时期转基因小鼠中Alfy在mRNA水平上的表达未见到明显的变化。结论：在正常小鼠脊髓中Alfy主要分布于神经元的核中；症状早期和终末期SOD1-G93A转基因鼠的神经元细胞中Alfy由胞核向胞浆移动，并能与胞浆中突变的SOD1共定位。第二部分ALS神经元模型中，Alfy对突变SOD1蛋白的影响目的：本研究的目的是研究在运动神经元细胞（NSC34细胞）中突变SOD1对内源性Alfy蛋白表达的影响和Alfy对突变SOD1蛋白表达的影响，以探讨Alfy对ALS相关蛋白突变SOD1的作用。方法：在NSC34细胞中分别瞬时表达空质粒、野生型SOD1质粒、SOD1-G93A质粒,然后用Western印迹检测细胞内Alfy蛋白的表达水平。在NSC34细胞中共转染c末端的Alfy（Alfy2981-3526）和human SOD1，然后应用免疫印迹法检测human SOD1蛋白的表达水平。我们在NSC34细胞中共转染Alfy-shRNA和SOD1-G93A质粒，然后应用免疫印迹法检测SOD1-G93A蛋白的表达水平。结果：（1）与转染空质粒的对照组相比，转染wtSOD1或SOD1-G93A质粒的NSC34细胞中Alfy蛋白的表达水平下降了。（2）用western印迹检测共转染c末端的Alfy和human SOD1的细胞中human SOD1的表达水平，结果显示与对照组相比，细胞中humanSOD1蛋白表达水平下降了。（3）用western印迹检测共转染shRNA-Alfy和SOD1-G93A的细胞中SOD1-G93A的表达水平，结果显示与对照组相比，敲降Alfy（KD）后能明显的抑制SOD1-G93A蛋白的降解。结论：过表达突变SOD1的细胞中Alfy蛋白的表达水平下降了；Alfy对于细胞内突变SOD1的降解是必需的。第三部分ALS神经元模型中，Alfy对突变TDP-43蛋白影响的研究及机制探讨目的：本研究的目的是研究在运动神经元细胞（NSC34细胞）中突变TDP-43对内源性Alfy蛋白表达的影响和Alfy对突变TDP-43蛋白表达的影响，并进一步探讨Alfy通过何种途径降解突变TDP-43蛋白。方法：在NSC34细胞中分别瞬时表达空质粒和TDP-25质粒,然后用real-time PCR和Western印迹检测细胞内Alfy的mRNA和蛋白的表达水平。在NSC34细胞中共转染c末端的Alfy和TDP-43(WT、Q331K、和M337V TDP-43)和TDP-25质粒，然后应用免疫印迹法检测TDP-43(WT、Q331K、和M337V TDP-43)和TDP-25蛋白的表达水平。我们在NSC34细胞中共转染Alfy-shRNA和Q331K TDP-43或M337V TDP-43或TDP-25质粒，然后应用免疫印迹法检测细胞内Q331K TDP-43、M337VTDP-43和TDP-25蛋白的表达水平。分别选用自噬通路阻断剂（3MA和Bafilomycin A1）和蛋白酶体通路阻断剂（MG132）处理共转染c末端的Alfy和TDP-25的细胞，应用免疫印迹法观察过表达的Alfy通过什么途径降解聚集的TDP-25蛋白；用CCK-8和LDH法检测过表达Alfy是否能减少细胞内TDP-25产生的毒性。结果：（1）与转染空质粒的对照组相比，转染TDP-25质粒的NSC34细胞中Alfy的mRNA和蛋白的表达水平下降了。（2）用western印迹检测共转染Alfy2981-3526和TDP-43(WT、Q331K、或M337V TDP-43)或TDP-25质粒的细胞中humanTDP-43和TDP-25的蛋白表达水平，结果显示与对照组相比，细胞中humanTDP-43和TDP-25蛋白表达水平下降了。用CCK-8和LDH法检测显示Alfy能减少TDP-25对细胞的毒性。用western印迹检测共转染shRNA-Alfy和突变的TDP-43或TDP-25的细胞中TDP-43和TDP-25的表达水平，结果显示与对照组相比，敲降Alfy（KD）后能明显的抑制这些蛋白的降解。（3）在NSC34细胞中共表达Alfy2981-3526和TDP-25质粒后，给予自噬通路阻断剂（3MA, Bafilomycin A1）和蛋白酶体通路阻断剂（MG132）阻断处理后，western印迹检测结果表明，Alfy在给予3MA和BafilomycinA1处理的情况下，不能降解TDP-25蛋白水平，相反，在MG132存在的情况下，仍然可以降解TDP-25蛋白。结论：Alfy主要是通过自噬通路降解与ALS相关的TDP-43和TDP-25错误折叠的蛋白。并能够减少这些蛋白产生的毒性，从而起到保护细胞的作用。