目的 将EBV潜伏膜蛋白编码基因LMP2A和EBV即刻早期基因BZLF1进行融合,构建融合基因的重组腺病毒表达载体,旨在同时发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因产物诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,从而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞,为EBV相关肿瘤特异性治疗的临床应用研究奠定试验基础。 方法 自EBV阳性细胞提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸（spliced overlap exetension,SOE）技术,将两段基因通过多肽接头（Gly₄Ser）₃ DNA序列连接以获得融合基因（Z2A）。进一步将Z2A融合基因定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,构建Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,包装获得重组腺病毒vAd-Z2A。流式细胞术检测重组腺病毒感染EBV阳性鼻咽癌细胞CNE诱导的凋亡。 结果 ①重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;②RT-PCR显示重组腺病毒感染的CNE细胞可检测到融合基因表达;③Western Blotting可检测到融合蛋白的表达;④流式细胞术检测显示重组腺病毒感染CNE细胞诱导的凋亡与vAd-LacZ载体对照和空白对照比较差异均有统计学意义（P<0.001）。 结论 本研究成功构建了EBV潜伏膜蛋白基因LMP2A和即刻早期基因BZLF1融合基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中包装获得重组腺病毒vAd-Z2A,重组腺病毒vAd-Z2A可在靶细胞内稳定表达目的基因并能诱导EBV阳性CNE细胞的凋亡。