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研究背景急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是心血管病学领域内最常见的危急重症,其致死率高。如何有效及时的让缺血心肌恢复血供是挽救心脏的关键步骤,它能有效地减少心肌梗死面积,提高患者的远期心脏功能,降低死亡率。然而,给缺血心肌恢复血供这一过程伴随着心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),后者将导致心梗面积进一步增大,临床预后不佳。因此,寻找内源性对抗MIRI的方法将可能成为防治缺血性心肌病的新思路。缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors,HIF)是介导哺乳动脉细胞内缺氧反应的核转录复合体之一。当细胞处于低氧环境中时,HIF可在基因转录水平对细胞的缺氧变化发挥主要调节作用。缺氧诱导因子-2α(Hypoxia-inducible factor 2-alpha,HIF-2α)亚基是调节缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor 2,HIF-2)活性的功能亚单位。既往的研究已表明,HIF可以通过诱导缺血预适应发挥心脏保护作用。此外,有文献报道HIF-2α可通过诱导心肌细胞中AREG的表达发挥抗MIRI的作用。与野生型小鼠相比,敲除HIF-2α的小鼠心肌坏死面积明显增大。然而,目前有关HIF-2α参与MIRI的作用机制尚未完全阐明,其下游的调控机制有待进一步的探究。白介素-6(Interleukin 6,IL-6)作为一种多效的细胞因子,在炎症反应中起着核心调节作用。IL-6不仅在急性期反应、免疫应答过程中发挥重要作用,同时参与调控机体造血。值得注意的是,IL-6的信号通路最终效应与信号的持续时间以及下游级联激活信号密切相关。其在炎症急性期IL-6往往发挥抗炎作用,伴随着炎症反应进展,这种抗炎作用逐渐转换为促炎效应,对机体产生不利影响。在心脏亦如此,在急性期,IL-6通过诱导心肌细胞的抗凋亡程序来保护心肌组织,并触发预适应反应。然而,当IL-6信号传导长期持续时,这些保护性反应就会致病并导致心肌细胞功能下降,心肌收缩力下降,左心室增大。临床研究发现,AMI患者的心肌坏死面积与血浆IL-6的水平存在相关性。IL-6与冠心病尤其是AMI患者的预后存在相关性。细胞研究也提示IL-6参与了 MIRI作用,并且心肌分泌的IL-6在MIRI相关的心功能障碍中也起到重要作用。然而,有关IL-6参与抗MIRI的上游调控机制至今尚未阐明。有关HIF-2α与IL-6的作用关系在肿瘤、骨关节炎等研究领域都有文献报道。既往研究表明,在小鼠的关节软骨细胞中,IL-6是HIF-2α的直接靶基因。HIF-2α可诱导软骨细胞中IL-6特异性受体的上调。然而,在急性心肌梗死MIRI方面还没有相关的研究。研究目的本研究旨在探讨:(1)HIF-2α在MIRI中发挥保护作用及其可能的机制;(2)IL-6参与HIF-2α在MIRI中保护作用可能途径和分子机制。研究方法通过建立体外心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)模型和小鼠体内缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)模型开展相应研究。采用H9c2大鼠心肌细胞系和AC16人心肌细胞系,利用Sci-tive厌氧低氧工作站建立心肌细胞H/R模型,选择缺氧6小时、复氧6小时作为缺复氧模型,检测HIF-2α、IL-6的表达量(蛋白和mRNA)、心肌细胞坏死及凋亡的相关指标。构建HIF-2α基因特异性下调慢病毒载体,利用其敲低内源性HIF-2α后,对心肌细胞系进行H/R处理,利用AnnexinV/PI双染流式检测细胞早期凋亡,利用CCK8检测细胞存活,运用western blot以及QPCR检测IL-6蛋白和mRNA水平的变化。通过染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)实验进一步验证HIF-2α对IL-6转录水平具有直接调控作用。采用雄性C57BL/6小鼠,构建HIF-2α特异性敲低的9型腺相关病毒载体(AAV9-shHIF-2α)完成HIF-2α在体敲低,4周后通过在体结扎小鼠前降支建立I/R模型(缺血2小时,再灌注24小时)。采用Western blot检测两组小鼠IL-6蛋白的表达水平变化,使用TTC(Triphenyltetrazolium chloride)和伊文思蓝染色评估小鼠心梗面积,同时检测血清乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogena,LDH)和肌钙蛋白I(Troponin-I,TnI)的释放水平,进一步明确HIF-2α在MIRI过程中发挥保护作用及其对IL-6的调控。为进一步确定IL-6是否参与了 HIF-2α对心肌缺血/再灌注的保护作用,我们通过构建IL-6特异性敲低的9型腺相关病毒载体(AAV9-shIL-6),完成在体敲低IL-6后4周建立小鼠在体I/R模型,采用TTC和伊文思蓝染色评估小鼠心肌梗死面积,同时检测血清LDH和TnI水平。应用AAV9-shIL-6和AAV9-shHIF-2α分别感染小鼠,再予以外源性补充IL-6,评价其能否逆转小鼠MIRI,同时检测蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Protein-serine-threonine kinase,AKT)信号通路的磷酸化水平。结果体外实验显示,敲低内源性HIF-2α后,心肌细胞在经过H/R处理后,细胞凋亡的比例增加,同时IL-6的蛋白和mRNA表达量下降。Chip实验显示,在IL-6基因的启动子区域存在2个HIF转录因子应答原件,在低氧状态下HIF-2a抗体募集的IL-6基因的启动区域的DNA丰富相较于常氧组更高,而IgG抗体组则没有显著差异。提示HIF-2α对IL-6转录水平具有直接调控作用。在体敲低HIF-2a基因的小鼠在经过I/R处理后,与对照组相比,两组缺血风险区面积基本一致,但敲低HIF-2α基因的小鼠心肌梗死面积明显增大,LDH和TnI表达量亦显著升高,IL-6的蛋白表达量明显下降。在体敲低IL-6的小鼠经过心肌I/R处理后,心肌坏死面积增大,LDH和TnI释放增加。给予补充外源性IL-6后,小鼠心肌梗死面积及程度减轻,p-AKT表达水平上升,心肌AKT活性明显升高。同样,对内源性敲低HIF-2α的小鼠补充外源性IL-6后,心肌梗死的范围和程度均较前减轻。Western blot结果也显示,p-AKT表达水平上升,心肌AKT活性明显升高。结论:HIF-2α在MIRI过程中起到保护作用,并对IL-6存在转录调控作用。IL-6参与了 HIF-2α对MIRI的保护作用。在这个过程中,PI3K/AKT信号通路被激活。提示:HIF-2α转录调控心肌细胞IL-6的表达发挥抗MIRI的作用。