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血友病A(hemophilia A, HA)是X染色体连锁的单基因隐性遗传病,其致病机理是患者有编码人凝血Ⅷ因子(factor Ⅷ, FⅧ)基因的功能缺陷,目前该病是基因治疗领域的研究热点之一。本研究组前期已经成功利用人核糖体基因区打靶载体(pHrneo)将人凝血因子VⅧ(hFⅧ)靶入到人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs) rDNA区,统一命名为ET5,再拟将ET5分化为适宜血友病A移植的特异组织细胞,以进行血友病A的基因治疗研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,在自体、同种异体甚至异种异体体内,能有效修复甚至完全重建功能严重受损的组织器官而不被排斥,不易发生恶性转化,已经成为基因治疗及组织修复等领域内的研究热点。已有大量研究表明MSCS可成为血友病A的理想靶细胞。但是成体MSCs取材较困难,而且难以体外长期扩增培养,从而一定程度上限制了MSCs在作为基因治疗靶细胞中的应用。因此本研究拟建立hESCs定向诱导成MSCs的平台,为获取数量足够的MSCs提供新的途径；本研究将以ET5为对象,定向诱导成MSCs,并检测分化后细胞中hFⅧ的表达情况,为后续血友病A基因治疗的临床前研究提供实验基础。目的：初步建立hESCs定向诱导成MSCs的技术平台,并研究由hESCs定向诱导的MSCs是否与骨髓来源MSCs的特性一致,以及外源基因在ET5诱导的MSCs中的表达情况。方法：1.对ET5进行碱性磷酸酶染色检测后,联合bFGF,PDGF-BB等细胞因子诱导ET5向MSCs分化,并进行核型检测；2.鉴定ET5诱导的MSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞分化的能力；3.流式分析ET5、ET5诱导的MSCs以及骨髓来源MSCs表面标志物的表达情况；4. RT-PCR检测ET5诱导成MSCs后Oct4、 Sox2和Nanog基因的表达变化；5RT-PCR检测由ET5诱导的MSCs中hFⅧ在RNA水平的表达情况。结果：1.ET5碱性磷酸酶染色阳性,表明ET5具备多潜能性,将ET5诱导成MSCs后,具有与骨髓来源的MSCs一致的细胞形态,在体外长期培养传代后仍保持核型正常；2.ET5诱导成的MSCs,在体外仍具备多向分化潜能,可分化成成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞；3.流式分析ET5诱导的MSCs和骨髓来源的MSCs表面标志物表达情况一致；4RT-PCR检测定ET5诱导成MSCs后,Oct4、Sox2和Nanog基因表达下调；5.在ET5诱导的MSCs’中可检测到外源基因hFⅧ在RNA水平的表达。结论：本研究成功将定点整合hFⅧ的hESCs定向诱导成MSCs,并具有较高的诱导效率；外源基因hFⅧ能在定点整合的hESCs诱导而来的MSCs中表达。