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Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导沉默复合物(RISC，RNA-indeced silencing complex)的核心元件，能够与小RNA结合，对靶基因进行剪切或抑制其表达。小分子RNA是生命活动重要的调控因子，在基因转录和转录后加工，个体发育，遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的作用。近来研究发现，转座子(TE，Transposable element)可以产生小RNA发挥作用，而家蚕中近一半的基因组序列为转座子基因。课题前期研究我们通过RIP-seq法鉴定和分析了家蚕BmN细胞中BmAGO2蛋白结合的RNA，发现BmAGO2结合RNA中存在大量TEs及TEs来源的小RNA(TE-siRNA)，其中BmAGO2结合TEs中，Bm1645的丰度远远大于其它结合的TEs，而Bm1645来源的TE-siRNA丰度也远远大于其它TEs来源的小RNA，表明Bm1645转座子是TE-siRNA的“生产基地”。在前期研究基础上，本课题进一步通过RIP-seq方法鉴定了家蚕五龄幼虫中BmAGO2蛋白的结合TE-siRNA和TEs，同时研究了转座子Bm1645来源TE-siRNA与BmAGO2蛋白的结合及其对Bm1645表达调控的关系。 本研究主要内容包括：⑴利用前期获得的高效价BmAGO2蛋白单克隆抗体，通过免疫共沉淀法获得家蚕五龄幼虫内源性BmAGO2蛋白复合物，并成功分离其结合RNA，将50nt以下小RNA与200nt以上长链RNA分别进行高通量测序及生物信息学分析，鉴定BmAGO2结合的TEs和TE-siRNA。结果表明，家蚕五龄幼虫BmAGO2结合RNA中同样含有大量TEs和TE-siRNA，其中转座子Bm1645丰度(RPKM=73982.57)远远大于其他转座子丰度，同时Bm1645来源TE-siRNA丰度(1814707)也远远大于其他转座子来源TE-siRNA丰度，与前期BmN细胞实验结果相符。上述结果进一步证明，家蚕BmAGO2蛋白可结合大量TE-siRNA和TEs，尤其是Bm1645转座子及其来源的TE-siRNA，推测Bm1645来源TE-siRNA可能结合BmAGO2介导Bm1645的表达。⑵选取来源于Bm1645的6条TE-siRNAs，通过凝胶阻滞实验验证TE-siRNA能否与BmAGO2蛋白结合。结果表明，有4条TE-siRNAs可以和BmAGO2蛋白结合产生凝胶阻滞条带，分别为TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688，表明这4个TE-siRNAs可能结合BmAGO2蛋白行使功能。推测Bm1645来源的TE-siRNA能够与具有活性的BmAGO2蛋白结合，从而影响Bm1645的表达。进一步采用双荧光素酶实验验证了4个TE-siRNAs在Bm1645上的识别位点。选取四个TE-siRNAs在Bm1645基因上对应的靶位点序列及其突变序列，分别克隆到pIEx-1-Rluc-Luc载体（本实验室构建的双荧光素酶载体）。将重组后的载体与合成的TE-siRNA共转染家蚕BmN细胞，采用双荧光素酶报告法检测。结果显示，与突变对照相比，转染正常靶位点序列载体和TE-siRNA后，报告基因萤火虫荧光素酶催化底物的发光值显著降低(p＜0.05)。说明TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688能够结合Bm1645的靶位点并抑制基因表达。⑶验证了TE-siRNA对Bm1645转座子的表达调控作用。将合成的TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688 mimics分别转染家蚕BmN细胞，荧光定量PCR法检测Bm1645的转录水平。结果显示，与阴性对照相比，转染TE-siRNA mimics后Bm1645在BmN细胞中的转录水平均出现了显著的下调(p＜0.05)，进一步证实TE-siRNA能够与BmAGO2蛋白相互作用，并调控TEs的转录水平。本课题首次鉴定了家蚕转座子来源TE-siRNA可以结合BmAGO2蛋白并在其介导下调控转座子的表达，为家蚕乃至昆虫中新型小RNA的鉴定与功能研究打下基础。