[目的]神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,手术、放疗及辅以替莫唑胺TMZ为主的化疗已成为I临床的一线治疗措施。TMZ的抗癌作用主要是由06-meG介导的,但肿瘤细胞DNA修复系统中MGMT可以修复06-meG介导的化疗作用而导致TMZ的疗效降低,而产生耐药性[1]。TMZ在治疗胶质瘤的过程中存在很大的个体差异,固有的或获得性耐药限制了 TMZ在临床的运用。特别是随着使用化疗药物的数量和次数的增加,逐渐由对药物敏感的细胞转向耐药的肿瘤细胞系。随着首次证明了肿瘤细胞内存在低氧的情况并且诱导其生物学行为的改变加速了肿瘤恶性转变,如抑制细胞增殖、加强了耐药基因表达、抗凋亡促进肿瘤生长、下调DNA修复基因启动及增加基因的不稳定等。在低氧微环境的条件下使胶质瘤对化疗药物的敏感性逐渐降低甚至完全耐药。因此在低氧条件下MGMT的表达是否受影响?TMZ的敏感性是否随之改变?以及其耐药机制是本实验所需要探索的。本研究主要采取T98 G、U251、HAC三种细胞在不同的低氧浓度及不同浓度的TMZ作用下研究化疗药物敏感性、使用TMZ通过大剂量冲击法逐步诱导胶质瘤细胞系建立耐药细胞株、以新的耐药脑胶质细胞系进行低氧条件下培养筛选出与化疗药物耐受相关的MGMT蛋白相互比较,证实其表达同时分析蛋白变化情况并探索期耐药机制。[方法]利用三气培养箱效仿胶质瘤所需低氧微环境建立梯度低氧微环境。将T98G、U251、HAC三种细胞分别在0.5%、1%、3%、21%(常氧)条件下,即前三个条件为实验组,常氧条件为对照组。用完全培养基(DMEM88%+10%FBS+0.5%P/S+0.5%HEPES)培养,记录每个阶段的变化,同时模拟TMZ的临床用药程序,采取恒定药物浓度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 g/L)、周期性作用的方式(1、3、5、7、9天)进行诱导;在处于对数生长期,按常规培养待细胞恢复生长,间断性按照倍数给予加药,不断进行诱导,最终获得抗药性稳定的耐药株,依据培养基的颜色变化、细胞生长的速度、密度及时更换新鲜的已配制的完全培养基,筛选出耐药株,以MTT实验观察细胞生长曲线、细胞生长抑制率以及细胞形态学的变化情况,将建立的耐药细胞株命名为 T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ。利用 Western blotting 检测不同氧浓度条件下MGMT的表达及含量分析比较。[结果]T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ耐药细胞株的建立采用恒定浓度的TMZ浓度、周期性作用的方式,经过反复总共6次的用药过程,历时6个月,成功地建立了对TMZ具有稳定抗药性的T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ三种细胞的耐药指数分别为:T98G/TMZ(RF)=10.84、U251/TMZ(RF)=8.41、HAC/TMZ(RF)=11.11,即的耐受程度约为11倍、8.5倍、11倍。三种新的耐药株分别在0.5%氧浓度、1%氧浓度、3%氧浓度条件下培养,以第七天、TMZ浓度为0.2g/L时为观察点,可见细胞形态主要发生了胞体、胞核变大,异型性增加,更加显著的变化表现为细胞向各个方向伸出多个细长伪足形态学的改变,经MTT实验检测得出三种细胞在不同的氧浓度条件下均存在差异,尤其以1%氧浓度条件下抑制率减小、存活率增加。经Western blotting检测发现MGMT蛋白的含量各组间有差异,T98G和U251细胞在1%氧浓度条件下较强,T98G在0.5%氧浓度条件下MGMT蛋白表达最弱,HAC在不同氧浓度条件下MGMT蛋白表达情况无明显差异。[结论]不同的低氧条件下同一耐药株耐药性无差异,即存在肿瘤异质性;适度的低氧(1%氧浓度)条件下MGMT可能与其它耐药机制存在协同作用,产生耐药性。