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戊型肝炎病毒（HEV）感染是一种能够在全世界引起急性病毒性肝炎的疾病,免疫功能低下的患者极有可能发展成慢性感染。目前主要鉴定出四种可感染人类的HEV基因型,其中基因1型和2型主要经粪口途径在人群中传播,而基因3型和4型会导致人畜共患病,在发达国家引起散发病例。近年来,HEV基因4型成为我国流行的主要基因型。家猪被认为是HEV基因4型的主要宿主,是人畜共患型HEV的主要传染源。疫苗接种是预防HEV感染的最有效策略。我国首例HEV疫苗（Hecolin）已经商品化,具有安全性和免疫原性。世界卫生组织建议,这种戊型肝炎疫苗只适用于基因1型和2型HEV高度流行地区,而由人畜共患病基因3型和4型引起散发病例的非流行地区则无法采取该预防策略。猪圆环病毒2型（PCV2）是一种小型致病性DNA病毒。它引起猪断奶后多系统衰竭综合征,这是一种多因素疾病,会给世界不同地区的养猪业带来严重的经济损失。在中国,疫苗是预防PCV2感染的最佳措施。因此,本项目旨在设计和开发新型猪嵌合疫苗候选物,一方面可以预防和控制猪群中HEV和PCV2感染,另一方面可以减少和控制人畜共患型HEV向人群的传播。为此,本课题进行了如下研究:一.HEV-PCV2最佳嵌合蛋白的生物信息学分析和分类方法:为了研制HEV-PCV2嵌合疫苗,本研究采用计算机模拟方法设计新的嵌合抗原,该抗原同时含有HEV和PCV2的主要免疫原性结构域。我们首先选择4个HEV ORF2蛋白片段（基因4型）,其中包含本课题组先前评估过的显性HEV 中和抗原表位,即:p222（aa439-660）、p179（aa439-617）、p166（aa452-617）和p146（aa460-605）。对于PCV2,选择能引起保护性免疫的PCV2基因型2b的衣壳蛋白（PCV2cp,233aa）与HEV抗原结合。然后我们将PCV2cp与四种HEV蛋白的N端或C端结合,设计出8种HEV-PCV2嵌合蛋白。运用多种免疫信息学和计算方法对8种嵌合蛋白进行分析,预测目标蛋白的3D结构,并计算不同模型中HEV和PCV2cp关键表位的相对溶剂可及性,最后评估HEV和PCV2片段的抗原表位,并根据抗原性/免疫原性对8种嵌合蛋白进行分类。结果与讨论:本研究对HEV-PCV2嵌合蛋白的三维结构进行了预测和优化,并选择最佳模型进一步分析。HEV和PCV2关键表位残基与周围环境的相对溶剂可及性分析显示:连接到HEV片段的N端或C端可能不会影响PCV2的抗原性。但HEV关键表位位点是否会暴露可能取决于嵌合蛋白中PCV2片段的位置（N或C端）和所连接的HEV片段长度。结论:计算机模拟分析的结果表明,HEV-PCV2嵌合蛋白作为候选疫苗从最佳到最差依次为:nPCV2cp-p166、p166-cPCV2cp、nPCV2cp-p222、nPCV2cp-p179、p222-cPCV2cp、p146-cPCV2cp、p179-cPCV2cp和 nPCV2cp-p146。二.HEV-PCV2嵌合蛋白的表达、纯化和表征方法:本章评估了所有HEV-PCV2嵌合蛋白的表达、溶解度、热稳定性以及组装成病毒样颗粒的能力。首先采用分子克隆技术,扩增HEV-PCV2结合基因并插入pET-24a（+）表达载体,然后将表达目的基因的载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中。使用IPTG诱导融合蛋白表达,然后运用SDS-PAGE分析溶解度,并在天然条件下运用Ni-NTA亲和层析法纯化可溶性蛋白。将这些纯化蛋白分别储存在不同温度下,然后分析不同时间点的降解率,以确定纯化蛋白的热稳定性;最后采用透射电子显微镜观察纯化的靶蛋白是否能够自组装成病毒样颗粒（VLPs）。结果与讨论:所有扩增的编码目的蛋白的DNA片段（单独及联合）均正确插入pET28a+载体中,且重组物成功转化至大肠杆菌感受态细胞中。8种HEV-PCV2嵌合蛋白均能在大肠杆菌中成功表达。但这些蛋白中只有5种为可溶性表达（在 25℃下以低 IPTG浓度诱导 14 小时）:即 p222-cPCV2cp、p166-cPCV2cp、nPCV2cp-p222、nPCV2cp-p166和nPCV2cp-p146。这些可溶性蛋白在天然条件下被高效纯化。此外,纯化的HEV-PCV2嵌合蛋白与单独HEV和/或PCV2抗原相比有更好的热稳定性。透射电镜结果显示HEV-PCV2嵌合蛋白nPCV2cp-p222、nPCV2cp-p166、cPCV2cp-p146 和 p166-cPCV2cp 能够自组装成不同直径（21～30nm）的球形病毒样小颗粒;而p222-cPCV2cp蛋白仅形成大量各种形态的聚集体。结论:本研究成功地在大肠杆菌中制备了 8种HEV-PCV2嵌合蛋白,其中5种蛋白质为可溶性表达（nPCV2cp-p222、nPCV2cp-p166、cPCV2cp-p146 和 p166-cPCV2cp）,因此能够在天然条件下高效纯化。这些可溶性嵌合蛋白在低温（4℃,-20℃和-80℃）下储存时非常稳定。除p222-cPCV2cp外,这些嵌合蛋白还具有自组装成VLPs的能力。三.评估HEV-PCV2嵌合蛋白的抗原性和免疫原性方法:在本章中,我们评估了 PCV2cp和5种纯化的HEV-PCV2嵌合蛋白（222-cPCV2cp,p166-cPCV2cp,nPCV2cp-p222,nPCV2cp-p166和 nPCV2cp-p146）的抗原性/免疫原性。采用间接ELISA和Western-blot法,通过检测蛋白质对PCV2特异性抗体及HEV中和性单克隆抗体5G5的反应性来评价抗原性。在免疫原性实验方面,分别用目标蛋白PCV2cp、p222-cPCV2cp、p166-cPCV2cp、nPCV2cp-p222 和 nPCV2cp-p166 免疫 BALB/c 小鼠,每种蛋白质均使用10 μg和30 μg两种剂量。对照组分别接种HEV p222,市售PCV2灭活疫苗（DBN-SX07株）和PCV2重组亚单位疫苗。小鼠在初次免疫后的两周接受第二次免疫。于初次免疫后的第1、2、4、8、12和14周采集血液样本,运用间接ELISA法检测血清中的HEV和PCV2特异性抗体。结果与讨论:ELISA和Western-blot结果表明:PCV2抗原单独或与HEV抗原结合,均可与PCV2b灭活疫苗（DBN-SX07株）诱导的小鼠抗体以及市售的猪多克隆抗体（用于治疗猪圆环病毒相关疾病）发生反应。以上结果表明大肠杆菌产生的HEV-PCV2嵌合蛋白中PCV2cp的抗原性是保守的,这也与生物信息学分析结果一致。然而,关于HEV实体,ELISA结果表明,所有嵌合蛋白均与中和抗体5G5反应,但反应强度不同:其中p222-cPCV2cp的反应性很强,其次是 p166-cPCV2cp、nPCV2cp-p166 和 nPCV2cp-p222,而 nPCV2cp-p146 的反应性最低。除了 nPCV2cp-p146对HEV中和抗体没有反应外,以上这些结果均在Western-blot实验中得到了进一步证实。初次免疫后两周,所有接种嵌合蛋白的小鼠均产生了可检测到的HEV和PCV2特异性IgG抗体。在PCV2方面,所有实验组中的PCV2特异性抗体诱导的动力学非常相似,没有统计学上的显着差异。此外,所有嵌合蛋白的免疫原性均与单独PCV2cp相当。这些结果也与生物信息学分析一致（预测PCV2部分的免疫原性不会因其连接HEV片段而受到影响）。有趣的是,nPCV2-P222和nPCV2-P166组的抗PCV2抗体水平明显高于PCV2商业疫苗组。同样,所有嵌合蛋白中HEV特异性抗体的动力学都非常相似。但实验组的抗HEV抗体滴度明显高于p222对照组。这表明将PCV2部分连接到HEV片段可能对HEV片段的免疫原性产生协同作用。此外,在nPCV2cp-p166组中,抗HEV抗体水平显着高于其他实验组和对照组。在剂量方面,由10μg或30μg的嵌合蛋白诱导的针对HEV和PCV2的体液免疫应答没有显着差异,因此表明10 μg可能是接种HEV-PCV2嵌合蛋白的最佳剂量。结论:HEV-PCV2 嵌合疫苗候选物 p222-cPCV2cp,p166-cPCV2cp,nPCV2cp-p222和nPCV2cp-p166均显示出最佳的抗原性和免疫原性:它们能够对HEV和PCV2特异性抗体产生强烈反应,并在接种到小鼠体内时诱导产生这种抗体。与其他嵌合蛋白相比,nPCV2cp-p166可能引起最好的体液免疫应答反应,是HEV-PCV2嵌合疫苗的最佳候选者。