等温双链核酸扩增检测新技术研究

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核酸扩增技术是生化分析检测的热门研究领域,迄今为止已经发展出了众多基于核酸扩增的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)及其衍生技术,需要经过循环的变温过程,对仪器依赖性强,在现场快速检测等领域的应用具有一定的局限性;因此,发展简便快速、灵敏准确的等温核酸扩增技术具有非常重要的意义。本论文中,在以往链置换扩增的基础上,于完全等温条件下建立了一种指数式扩增检测双链核酸的新方法,并对该类型反应所出现的非特异性扩增进行了研究。本论文中,将切刻酶和聚合酶联合使用,在完全等温的条件下建立了一种扩增检测双链核酸的新方法。该方法实现了单链靶标的产生与扩增在封闭体系中及同一温度下进行,不需要额外的预变性等操作步骤,方法简便快速,灵敏准确。应用该方法对pBluescript Ⅱ KS(+)质粒(简称为PBS质粒)DNA进行了检测,当目标DNA浓度为1.0 fmol到1.0 zmol时,检测结果具有良好的线性关系;并且方法在复杂体系进行检测时,也表现出了较好的稳定性。为了检测该方法的实际应用能力,本论文对副溶血性弧菌进行了检测,结果显示,该方法可以将约100 zmol的基因组DNA检测出来,证明了本方法具有一定的实际应用能力。为了进一步提高应用本方法检测副溶血性弧菌的灵敏度,本论文探讨了应用分子信标代替Sybr Green Ⅰ进行信号检测的可行性;同时,为了探究该类型反应出现非特异性扩增的原因,本论文对含有切刻酶识别序列的引物所引起的非特异性扩增进行了研究,同时结合前人的研究成果进行了开放性探讨,总结出了一些经验,为进一步的研究提供了基础的资料。
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