猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，猪不分年龄、性别和品种均易感染，一年四季均可发生。我国是世界上养猪最多的国家也是猪瘟流行严重的国家之一，由猪瘟致死的猪占因各种疾病猪死亡总数的1/3，每年的经济损失达数十亿元，其严重危害养猪业发展。而目前对于猪瘟的治疗措施主要是疫苗接种免疫。我国在上个世纪50年代成功培育出了猪瘟兔化弱毒疫苗C株，事实证明该疫苗对于控制我国和世界上其他国家的猪瘟疫情起到了重大作用，是国际公认的安全有效的弱毒活疫苗。在猪瘟细胞苗的生产中需要牛睾丸细胞(NBTE)来繁殖猪瘟病毒，且在细胞生长繁殖过程中需要加入胎牛血清提供营养，因此有可能将牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)这种外源病毒带入猪瘟细胞苗中。另外，用含BVDV抗体的胎牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养。BVD与猪瘟CSF同属于瘟病毒属，BVD不仅可以感染牛，还可以感染猪，引起的临床表现与CSF相似。由于细胞苗的大规模的生产和使用，为保证在细胞苗的生产过程和最终产品的安全性和有效性。同时鉴于这两种疾病的临床表现非常相似，临床诊断容易引起混淆，早期的鉴别诊断对控制这两种疾病显得尤为重要。本实验建立了一种快速、敏感、特异的检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法，并且应用该方法对牛睾丸细胞、胎牛血清、猪瘟细胞苗及临床病料进行检测。　　 ⑴检测CSFV和BVDV双重RT-PCR方法的建立。参照GeneBank收录的猪瘟强弱毒序列进行对比，重点关注猪瘟兔化弱毒C株；BVDV主要参考标准毒株NADL株，同时兼顾其它的1型为主，对2型不能通用。找出CSFV和1型BVDV的基因序列差异较大的区域，同时兼顾同一病毒不同毒株的相对保守区域，设计合成了鉴别CSFV和BVDV的两对特异性引物。通过优化退火温度、Taq酶浓度等，建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法。应用该方法能扩增出大小约为938bp和650bp的目的片段。经过序列分析、敏感性试验、特异性试验和可重复性试验表明该双重RT-PCR方法可用于细胞、血清、疫苗和临床病料等的检测。　　 ⑵CSFV和BVDV双重RT-PCR方法的应用。利用建立的CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法对采集的11个批次牛睾丸细胞、不同厂家的7个批次的胎牛血清、6家不同生物制品厂生产的60个批次的猪瘟细胞苗、以及广东送检的某猪场10个全血样品和相对应的10个扁桃体样品进行检测。检测结果表明目前我们公司所采集的11批牛睾丸细胞和采购的不同厂家7个批次的胎牛血清均不存在BVDV污染的情况；6家不同生物制品厂的60个批次的猪瘟细胞苗也不存在BVDV污染，说明目前各个胎牛血清制品厂家和6家生物制品厂家对BVDV相当的重视。对于广东某猪场送检的样品进行比较检测，发现在10个全血样中检测不到CSFV和BVDV其中任何一种病毒，检出率为0；而从对应的10个扁桃体样品中4个样品检测出了BVDV，检出率为40％，说明这个养殖场存在BVDV感染现象。从一个侧面反映了不同的样品存在不同的检出率，扁桃体的检出率要高于全血样。经初步应用表明本研究建立CSFV和BVDV双重PT-PCR方法，可用于牛睾丸细胞、胎牛血清及猪瘟细胞苗的外源病毒检测、临床诊断、流行性病学调查，具有重要的应用价值和临床意义。