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多不饱和脂肪酸对人体健康有着重要的生理功能,对癌症和心血管疾病预防有着积极的作用。Δ9脂肪酸脱饱和酶（FADS9）是将第一个碳碳双键引入脂肪酸长链的酶,Δ12脂肪酸脱饱和酶（FADS12）和Δ15脂肪酸脱饱和酶（FADS15）是脂肪酸脱饱和通路中的关键酶,它们可以在缺乏结构特征的脂肪酸长链上对特定位点进行脱饱和作用,有着非常强的底物选择性和特异性。然而哺乳动物中的FADS12和FADS15基因在进化的过程中丢失,因此我们选择产油微生物模式菌株高山被孢霉中的FADS9、FADS12和FADS15进行研究。膜结合脂肪酸脱饱和酶由于表达量低和纯化上的困难,目前的研究进展主要局限于基因克隆、表达和体内功能验证方面,没有详尽的生化性质报道。因此,对高山被孢霉FADS9、FADS12和FADS15底物选择性和催化特性的研究不仅有助于脂肪酸脱饱和机理、结构与功能关系的解析,更有助于有重要价值的多不饱和脂肪酸的生产。本论文首先对高山被孢霉FADS9、FADS12和FADS15进行异源表达和纯化,获取足量纯的活性蛋白质,然后表达和纯化脂肪酸脱饱和电子传递体细胞色素b5（Cytb5）、NADH-细胞色素b5还原酶（Cytb5R）和NADPH-细胞色素P450还原酶（CytP450R）,构建体外脂肪酸脱饱和酶反应体系,测定脂肪酸脱饱和酶的底物选择性和催化特性,并通过初级结构分析、拓扑结构预测和三维结构预测等对结构与功能关系进行初步解析。主要研究结果如下:1.FADS9、FADS12和FADS15的表达和纯化:构建了含有ZZ标签和RGS-10?His标签和HRV 3C蛋白酶酶切位点的表达载体,转化入毕赤酵母表达并对高表达量转化子进行筛选;通过膜组分分离和去垢剂筛选确定Fos-Choline-16为溶解膜组分、提取脂肪酸脱饱和酶的最佳去垢剂;进而利用IgG亲和色谱、阳离子交换色谱和分子排阻色谱进行纯化,获得了均一的、纯的产物。FADS9具有完整融合细胞色素b5功能域;FADS12和FADS15具有双铁离子活性中心。2.脂肪酸脱饱和酶体外反应体系的构建:构建了含有6?His标签的细胞色素b5、NADH-细胞色素b5还原酶和NADPH-细胞色素P450还原酶表达载体,转入大肠杆菌进行表达;通过钴离子亲和层析、阴离子交换色谱和分子排阻色谱对蛋白质进行纯化;最终利用2,6-二氯靛酚钠（DCIP）为底物测定Cytb5R的活性为1072.0 U。在NADH和NADPH条件下,细胞色素b5还原酶和细胞色素P450还原酶可以分别与细胞色素b5相互作用,细胞色素b5被还原。3.FADS9、FADS12和FADS15底物选择性及酶动力学性质研究:利用以NADH为还原力的脂肪酸脱饱和酶体外反应体系对FADS12和FADS15的底物选择性和酶动力学参数进行测定,结果表明,FADS12的偏好性底物为18:1（ω9）,其Km和kcat值分别为5.4±0.8μM和0.9±0.04 min-1;FADS15的偏好性底物为18:2（ω6）,其米氏常数Km和反应常数kcat值分别为15.9±2.2μM和11.2±0.6 min-1;另外在以NADPH为还原力的反应体系中,脂肪酸脱饱和活性为NADH条件下的4060%,NADH为还原力时脂肪酸脱饱和有更高的效率。对于含有融合细胞色素b5功能域的FADS9,利用酿酒酵母破碎物系统对其活性和底物选择性进行测定,结果表明,FADS9对18:0和16:0底物有相近的转化率。4.FADS12和FADS15结构与功能关系的初步分析:初级序列比对、进化树分析和PolyPhobius程序拓扑结构预测和三维结构预测结果表明,FADS12和FADS15与FADS9具有相似的三维构象,其穿膜区域由四个穿膜α-螺旋构成,但其顶部区域构象有显著差异,其中只包含两个双亲性α-螺旋结构,FADS12含有β折叠结构,并且活性中心位置和底物结合通道有显著改变,这都为FADS12和FADS15对底物的选择性和在特定的位点进行脱饱和作用奠定了结构基础。