信号增强液晶生物传感方法及液晶核酸逻辑门研究

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液晶是物质介于液体和晶体之间的一种特殊物质形态,兼具有液体的流动性与晶体的各向异性,主要体现为光学各向异性和介电各向异性。液晶材料因其具有独特的物理、化学和光学性质,已广泛应用于各类低功耗、轻薄型的光电电子显示产品中,在信息通讯、航天航空、微电子等高新技术领域发挥着十分重要的作用。近年来,将液晶材料作为信号转换媒介构建起来的液晶生物传感器是一类新型的生物分析检测技术。液晶生物传感器是以生物活性材料(如抗原-抗体、蛋白质-配体、酶、核酸、微生物等)为识别元件,液晶材料为信号转换元件,利用液晶对偏振光的双折射性,将传感界面识别目标分析物前后的变化信息转换为液晶取向的变化,通过监测液晶光学图像的颜色、织构和光通量变化来实现目标分析物的检测。相比于其他类型的分析检测技术,液晶生物传感器无需特殊光源、常规载玻片即可构建,具有低成本、轻巧、简便的特点,易于实现微型化、阵列化和高通量的生物分析。目前,液晶生物传感器主要是用于监测抗原-抗体、蛋白质、核酸以及其他生物分子间的直接相互作用,对其进行定性或者半定量分析,普遍存在灵敏度偏低的问题。此外,该类技术的研究尚处于初级探索阶段,其相关理论基础和技术手段尚不成熟,还存在一定的局限性。因此,发展高性能的液晶生物传感方法,进一步探索液晶与敏感膜间的传感机制,总结其规律,拓展其在生物分析中的应用范围,对促进液晶生物传感技术的发展具有重要的研究意义。本文围绕这些问题,在构建高灵敏液晶核酸传感方法对核酸、酶和金属离子的检测分析,以及界面的传感机理研究进行了初步探讨,主要内容如下:第一部分固相-液晶相界面的信号增强液晶生物传感方法研究(1)基于液晶取向改变的原理,结合酶催化银沉积信号增强技术,提出了一种新型高灵敏液晶生物传感方法用于特定核酸序列分析。首先采用3-氨丙基三甲氧基硅烷(APS)和N,N-二甲基-N-[3(-三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵(DMOAP)以混合自组装的方式在玻片基底构建APS/DMOAP基底膜,便于消除背景干扰和固定捕获DNA探针,解决液晶有序排列对金膜的依赖;根据碱基互补配对原则,目标DNA探针和生物素化的信号DNA探针(biotin-DNA)先后捕获于基底表面;链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(Sv-ALP)通过biotin和Sv的特异性结合作用固定与玻片基底,ALP随后催化抗坏血酸磷酸盐水解成抗坏血酸(ASA),后者将银离子还原成银颗粒,使其沉积在DNA探针修饰过的基底表面。结果表明,酶催化沉积的银颗粒能改变敏感膜的表面形貌,有效地扰乱液晶分子的取向排列,导致产生显著的光学信号变化。该方法对浓度低至0.1pM特定核酸序列仍具有明显的光学响应,克服了生物分子的大小和固定量对灵敏度的限制,为发展高灵敏液晶生物传感方法提供新的研究思路。(2)利用核酸适体与其靶分子结合的高特异性和高亲和力,金纳米颗粒(AuNPs)良好的生物兼容性、较高的表面负载量和稳定的尺寸结构,以目标物凝血酶为分析模型,提出了一种基于核酸适体和金纳米颗粒的非标记液晶核酸传感方法。首先将5′端标记了-NH2的发卡型识别探针通过戊二醛交联作用固定于APES/DMOAP基底膜表面,凝血酶与识别探针环部的核酸适体片段结合形成G-四链体结构,可促进识别探针开环,有利于其3′端标记的生物素远离APES/DMOAP基底膜;链霉亲和素标记的纳米金通过生物素-链霉亲和素的特异性作用捕获于基底表面。结果表明,结合纳米金信号增强手段后,液晶生物传感的检测灵敏度有了显著提高,对凝血酶的检出限由10nM降低至1pM,金纳米颗粒是一种优良的信号增强媒介。该方法具有操作简单,响应迅速、灵敏度高和成本低的特点。第二部分液晶-水相界面的液晶生物传感方法及液晶核酸逻辑门研究(3)根据核酸探针的构象变化可诱导液晶-水相界面的液晶分子取向重排,以结肠癌的p53基因片段含282密码子突变为分析模型,提出了一种基于DNA树枝状聚合物信号增强的液晶生物传感方法。在该方法中,首先采用阴离子表面活性剂SDS作为液晶5CB的掺杂剂,初步探讨吸附在液晶-水相界面的DNA探针与液晶5CB间的直接相互作用机制;随后,以目标序列为引发剂,触发发卡型核酸探针进行杂交链式反应,形成大量含有双螺旋结构的DNA树形聚合物,用以加强核酸对液晶5CB的取向诱导能力。结果表明,双螺旋核酸分子的空间效应和界面双电层的电场诱导效应可共同驱动液晶5CB由倾斜取向重排为垂直取向;DNA树枝状聚合物信号增强的液晶生物传感可辨别浓度范围为0.08nM~8nM的目标序列。该方法无需多步生物固定化和洗涤步骤,操作更为简单,试剂用量少,具有较高的灵敏度和良好的选择性,可有效区分野生型和突变型的目标序列。(4)根据核酸探针的构象变化及其调控的界面双电层变化可诱导液晶取向重排,以金属离子Ag+和Hg2+为分析模型,构建了操作简单、响应快速、选择性高、智能化的“AND”和“INHIBIT”液晶核酸逻辑门对多目标分析物进行检测研究。“AND”逻辑器件是以富含T和C碱基的核酸探针为识别元件,其构象变化为分子逻辑开关,金属离子Ag+为第一种输入信号,Hg2+为第二种输入信号,液晶5CB织构图像的平均灰度强度为输出信号;当且仅当输入信号为(1,1)时,输出信号才为1,该逻辑器件可同时识别浓度低至6μM的金属离子Ag+和Hg2+。“INHIBIT”逻辑器件是以核酸探针的构象变化及其调控的界面双电层电荷密度变化为分子逻辑开关,H+为第一种输入,金属离子Ag+,Hg2+为第二种输入信号,液晶5CB织构图像的平均灰度强度为输出信号。当且仅当输入信号为(0,1)时,输出信号才为1;当输入信号为(0,0)、(1,0)和(1,1)时,输出信号均为0。“INHIBIT”逻辑器件不仅可以同时识别金属离子Ag+和Hg2+,还能辨别浓度低至200μM的强酸性物质。液晶核酸逻辑器件有望于开发成微型化、阵列化和智能化的新型分析检测技术,在生物传感、芯片制造和环境监测等领域具有重要的应用前景。
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