研究背景:过度炎症与多种疾病密切相关。血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)是一种表达于血管内皮细胞等多种细胞表面的糖蛋白,其具有重要的抗炎功能。因此,使得TM成为防治炎症相关疾病的措施中极具吸引力的一个重要的药物设计新来源。最近一项研究发现,TM是体内天然存在的唯一可以结合并中和晚期(或宽治疗窗口期)关键细胞因子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)而产生明显抗炎效应的分子,并初步明确了其参与作用的区域为TM的PD1(N-terminal lectin-like domain)(155aa)结构域。这一新发现为解决我们前期工作的瓶颈带来了契机。在前期的工作中我们曾想开发能拮抗HMGB1而作为潜在的HMGB1的阻断剂的HMGB1 A box结构域,然而,单独表达A box欠稳定性,且目前所报道的A box抗炎作用的文献中均是以融合蛋白形式来表达A box,鉴于此,我们曾思考是否能在解决A box单独表达欠稳定的同时,赋予其更强大的拮抗HMGB1的功能呢?值此,若能将均具有明显抗炎效应的TMPD1与HMGB1 A box融合表达,则有望获得一种具有双重抑制HMGB1的且稳定性更好的新型抗炎衍生分子,从而为相关疾病的治疗提供一种新型候选制剂。针对基于TM的抗炎措施,除了设计来源于TM的新型抗炎衍生分子外,如能设法上调TM的表达,无疑有助于与炎症相关的多种疾病的防治。法尼酯X受体(farnesoid X receptor, FXR)和肝X受体(Liver X receptor,LXR)均是核受体超家族成员,作为多功能转录因子,除了参与胆固醇、脂类和葡萄糖的代谢调节外,近年发现,抗炎作用是FXR及LXR的一项新功能,但关于其抗炎机制还有待深入阐明。由于FXR及LXR和TM均表达于血管内皮细胞,且均具重要抗炎功能,那么Tm是否是FXR或LXR的一个新靶基因?“通过上调TM而发挥抗炎功能”有无可能是FXR或LXR的一个抗炎新机制呢?弄清该问题,必须在首先证明FXR或LXR确实能影响TM表达,特别是能影响TM作为抗炎蛋白的活性的基础上,才能进行后续研究,从而为进一步深入而全面地阐明FXR或LXR的抗炎机理积累新的理论资料,为探索以FXR或LXR和TM为靶标的抗炎新措施提供科学依据。研究目的:鉴于TM在抗炎方面的重要作用,制备并筛选由TMPD1与HMGB1 A box组成的能双重抑制HMGB1的融合蛋白;同时,研究FXR、LXR对TM表达的影响,并初步探讨其可能机制。研究方法:1.基于TMPD1和HMGB1 A box的新型HMGB1拮抗分子的制备和功能鉴定分别克隆来源于人和小鼠的TMPD1 cDNA,在测序正确的基础上,用基因工程的方法分别将人或小鼠TMPD1 cDNA(分别处于融合分子的N端或C端)与本室已克隆好的人HMGB1 A box(人和小鼠HMGB1 A box氨基酸序列完全一致)直接相连或在二者之间引入一个柔性连接子Gly4Ser,待测序正确后,将各融合分子分别亚克隆于原核表达载体pQE-80L并在大肠杆菌DH5α中进行表达,进而纯化各种蛋白;通过体外抗炎实验,分别观察不同来源的融合蛋白是否具有优于单独TMPD1或HMGB1 A box拮抗HMGB1的功能,同时也可通过比较各融合蛋白在功能强度上的差异而筛选出其中活性最好的分子;进而在体外抗炎实验中分别观察不同来源的最优融合蛋白拮抗HMGB1是否具有剂量依赖性,进一步证实其抗炎活性;为防止小鼠产生免疫反应影响在体抗炎实验效果,我们使用来源于小鼠TMPD1的最优融合蛋白在LPS诱导的小鼠内毒素血症模型(模拟内毒素引起的系统性炎症)上验证其抗炎作用暨增加小鼠存活率的情况。2.法尼酯X受体、肝X受体可在血管内皮细胞中上调TM的表达选取人血管内皮细胞株Ea.hy926为细胞模型。在证明FXR及LXR在我们所选取的实验体系中是有功能活性的基础上,经FXR激动剂GW4064、CDCA及LXR激动剂GW3965分别处理24h后,RT-PCR和Real-time PCR法检测TM mRNA表达的变化;延长激动剂处理时间至48h,western blot法或流式细胞仪检测TM蛋白表达的差异;与此同时,发色底物法观察在FXR、LXR上调TM的表达水平后,能否增强抗炎效应分子活化蛋白C(activated protein C,APC)的产生能力,进一步证明FXR、LXR对TM活性的影响;在线分析人Tm基因转录起始位点上游(即5’调控区中)有可能存在的FXR或LXR结合位点,以此为线索,克隆人Tm基因启动子区域不同长度的片段,荧光素酶报告基因检测FXR或LXR对Tm基因启动子活性的影响,初步探讨FXR、LXR上调TM表达及活性的机制,为后续研究回答“Tm是否是FXR或LXR的一个新靶基因”奠定基础。研究结果:(1)成功制备并纯化hTMPD1、A/ hTMPD1、A/linker/hTMPD1、hTMPD1/ A、hTMPD1/linker/A、mTMPD1、A/mTMPD1、A/linker/mTMPD1、mTMPD1/A、mTMPD1/linker /A共10个重组蛋白,其中8个为融合蛋白;(2)体外抗炎实验表明,hTMPD1/A与A/mTMPD1分别是来源于人TMPD1组和小鼠TMPD1组中拮抗HMGB1功能的最优分子;(3)hTMPD1/A与A/mTMPD1拮抗HMGB1均具有剂量依赖性;(4)A/mTMPD1在LPS诱导的小鼠内毒素血症模型中能明显增加小鼠存活率;(5)FXR呈配体剂量依赖性的上调TM mRNA和蛋白表达;(6)FXR激动剂GW4064上调TM活化APC的能力;(7)荧光素酶报告基因检测初步提示FXR极有可能在Tm基因启动子区域-646～-481存在结合位点IR8(AGGTCCtcccaaagTGCCCT -503～-484);(8)LXR呈配体剂量依赖性的上调TM mRNA和蛋白表达;(9)LXR激动剂GW3965上调TM活化APC的能力;(10)LXR激动剂不影响我们所克隆到的Tm基因启动子区域-2494～+160的活性。结论:(1)所制备并筛选的TMPD1与HMGB1 A box融合蛋白是能双重抑制HMGB1且稳定性更好的新型抗炎衍生分子;(2)将TMPD1作为与A box组成融合蛋白的伴侣分子是既能增加其稳定性又能赋予其更强大的拮抗HMGB1功能的有效方法,从而为感染和炎症等相关疾病的治疗提供一种新型候选制剂制备策略;(3)融合蛋白的不同融合形式对融合蛋白的功能发挥影响很大,不同的融合形式适用于不同融合蛋白;(4)FXR极有可能结合Tm基因启动子区域的IR8位点直接上调TM表达;(5)LXR上调TM表达,但具体机制尚需进一步研究;(6)被FXR和LXR上调的TM是具有功能活性的。