第一部分 BATF2在原发性肝癌中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响　　 靶向治疗是一种极具前景的肝癌治疗方法,它针对肝癌生长过程中关键的基因或通路发挥抗肿瘤作用。因此,加强肝癌病因学的研究成为目前人类与肝癌抗争的关键之一。肝癌的发生过程是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程,牵涉到的分子遗传学的改变主要包括肿瘤抑癌基因失活,癌基因的激活,其中抑癌基因失活在肝癌的发生发展中起到了至关重要的作用。肝癌相关基因的深入研究,对于阐明肝癌的发病机理,肝癌的早期诊断及开发出新的治疗手段,进而提高肝癌患者的生存率都具有重要的意义。　　 是亮氨酸拉链蛋白亚家族的一员,并且为的抑制剂。最近的研究发现,在多种正常细胞系中可以检测到的,但在相对应的肿瘤细胞系中则检测不出;过表达基因可明显抑制肿瘤细胞生长,但对正常细胞的生长则没多大影响；并且将导入裸鼠的前列腺癌移植瘤,可明显抑制肿瘤的生长:以上结果均提示BATF2具有抑癌基因的特点。但目前关于BATF2在肝癌中的作用并不清楚。本课题对BATF2基因在肝癌中的表达进行了检测,分析了其表达水平与临床参数的关系,并且观察了BATF2基因对肝癌细胞Hep-G2增殖和凋亡等的影响,并对BATF2在肝癌中失活的机制进行初步探讨。　　 目的:　　 本研究旨在研究BATF2基因在肝癌中的表达,并且分析其表达水平与临床参数的关系,探讨过表达BATF2基因对肝癌细胞Hep-G2增殖和凋亡等的影响,并对BATF2在肝癌中失活的机制进行初步探讨。　　 方法:　　 应用real time RT-PCR、Western blot技术检测了BATF2在50对肝癌和癌旁组织,以及5种肝癌细胞系中的表达水平；利用免疫组化技术检测了114例肝癌石蜡包埋组织中BATF2的表达水平,分析了其与临床参数的关系,并且探讨了其与肝癌预后的关系；构建pEGFP-M03-BATF2重组质粒并转染肝癌细胞系Hep-G2,利用MTS观察BATF2过表达对肿瘤细胞增殖的影响,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,利用transwell小室迁移实验和平板克隆形成实验检测过表达BATF2对Hep-G2细胞迁移和克隆形成能力的影响；利用基因直接测序检测BATF2基因外显子的突变。　　 结果:　　 Real time RT-PCR检测发现,在所检测的50对肝癌组织及相应癌旁肝组织中,38例(76％)癌组织中的BATF2 mRNA水平比相应的癌旁组织明显降低,12例(24％)癌旁组织中的BATF2 mRNA水平低于相应的癌组织,显示BATF2mRNA水平在癌组织中显著降低(p=0.001)。相似地,相比于50例癌旁组织中的BATF2 mRNA平均水平,BATF2 mRNA在5种肝癌细胞系中的表达也显著降低。进一步利用Western blot检测BATF2的蛋白表达水平,结果45例(90％)肝癌组织中的BATF2蛋白水平低于癌旁组织,仅有5例(10％)肝癌组织中的BATF2蛋白表达水平高于癌旁组织,说明肝癌组织中BATF2的表达显著减少(p=0.0004)。同样地,5种肝癌细胞系中BATF2的蛋白表达也均显著降低。免疫组化检测发现,在114例肝癌组织中,有63例(55.2％)为BATF2阴性表达,分析BATF2表达与各临床参数之间的关系,发现BATF2表达与患者年龄(p=0.006)、肿瘤大小(p=0.046)和分化程度相关(p=0.030)。生存分析显示,BATF2低表达的患者生存时间较短(p=0.016)；多因素分析显示,BATF2低表达是肝癌患者的一个独立的预后因素(p=0.015)。将BATF2基因过表达于肝癌细胞系Hep-G2,则细胞的增殖受到明显抑制,诱导细胞凋亡,并降低细胞的迁移和克隆形成能力。对5种肝癌细胞系及8对肝癌及癌旁组织中的BATF2基因进行突变分析,并未发现BATF2外显子的突变。　　 结论:　　 BATF2基因在肝癌的发生发展中起重要作用,作为肝癌相关的候选抑癌基因,它的低表达导致患者不良的预后。　　 第二部分射频消融联合RetroNectin刺激的自体T淋巴细胞治疗原发性肝癌　　 原发性肝癌是世界上第五大恶性肿瘤,位居肿瘤死亡因为的第三位。在我国,肝癌是第二号癌症杀手,且发病率呈逐年上升趋势。肝癌具有起病隐匿,侵袭性生长快速,恶性程度高,治疗后易复发,病死率高等特点,尽管治疗手段发展迅速,但肝癌五年生存率仍较低。寻找有效的肝癌治疗方法仍是人们努力的方向。目前,包括手术、化疗、放疗和生物治疗的综合治疗已被广大临床医师接受。　　 射频消融在临床上被广泛用于治疗直径小于5 cm的肝癌,但复发转移率高。大多数肝癌患者的免疫力低下,被认为是肝癌复发和转移的重要因为之一。射频消融可以释放和暴露更多的肿瘤抗原,为射频消融和免疫治疗的联合应用提供了理论基础。RetroNectin是一种重组的人纤维蛋白片段,最近发现固定在培养介质上的RetroNectin可以在抗CD3单抗的协同作用下使T淋巴细胞活化,增殖速度明显加快。本课题对联合射频消融和RetroNectin刺激的自体T淋巴细胞治疗原发性肝癌的安全性和有效性进行了探讨,为寻找新的肝癌治疗策略提供了有益的参考。　　 目的:　　 评价射频消融(RFA)联合Retronectin刺激的自体T淋巴细胞(RAK)回输治疗原发性肝癌的安全性和疗效；评价RAK细胞通过肝动脉灌注与静脉滴注两种方式对临床效果的影响。　　 方法:　　 按照入选标准入组肿瘤直径≤5cm的肝癌患者,共入组30名患者,分为3组:静脉滴注组、肝动脉灌注组和对照组。所有患者的肝脏病灶均接受射频消融术治疗,静脉滴注组和肝动脉灌注组均接受RAK回输治疗,每2周1次,共6次。静脉滴注组患者经外周静脉回输RAK细胞,肝动脉灌注组患者经肝动脉灌注RAK细胞至病灶局部。自RFA结束之日起进行随访。　　 结果:　　 利用RetroNectin技术,每次由病人的50 ml外周血培养获得1.17-2.68×1010个RAK细胞,比普通CIK培养效率更高,且以效应型CD8+T细胞CD45RA+CCR7-为主。RAK细胞在体外对两种肝癌细胞Hep-G2和BEL-7402均有明显的杀伤作用。给予RAK细胞回输后,未发现病人有严重不良反应。联合治疗结束后,患者外周血CD3+CD8+细胞的比例明显增加,CD3+CD4+细胞比例和CD4+/CD8+明显下降,肝动脉灌注组患者外周血的CD8+CD25+细胞比例也降低。联合治疗组患者外周血AFP降至正常水平的比例高于对照组。截止到目前,各组均未出现死亡病例,静脉滴注组、肝动脉灌注组和对照组分别有3例,6例及4例病人治疗后首次复发。　　 结论:　　 本试验初步证实了RFA联合RAK细胞回输治疗原发性肝癌的安全性；静脉滴注组比对照组的随访时间更长,而复发病例更少,提示RFA联合RAK细胞静脉滴注治疗原发性肝癌的效果可能比单纯RFA治疗更好；而肝动脉灌注组的疗效并未显示比静脉滴注组有优势。