研究背景伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)是近年来牙周炎细菌病因学研究领域中的热点,是一种公认的牙周致病菌,特别是与侵袭性牙周炎关系密切。Aa以生物膜形式寄居在人类口腔中,在生长期间排出许多膜泡,内含内毒素、白细胞毒素和骨吸收因子等毒性因子。其产生的内毒素及以白细胞毒素(leukotoxin, LT)为代表的细胞致死膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)等可溶性介质能够降低宿主抵抗力,导致牙周组织的迅速破坏,在牙周炎的发生与发展过程中起重要作用。磷脂酰胆碱(phosphorylcholine, PC)是动植物细胞的必需组分,富含于神经组织,特别是髓鞘和蛋黄中。研究发现PC存在于多种病原菌中,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。目前的研究表明PC可能是病原菌的重要致病因子。目前,磷脂酰胆碱在大部分病原菌的致病机制中的作用尚不清楚。通过对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等的研究发现,细菌细胞壁的胆碱成分通过与内皮细胞表面的血小板活化因子受体(Platelet activating factor-receptor, PAFR)结合来介导侵袭。PAFR分布于多种内皮细胞和上皮细胞表面,PAFR的天然配体血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)含有磷脂酰胆碱,细菌细胞壁中的磷脂酰胆碱可通过模拟血小板活化因子,与血小板活化因子受体结合而帮助细菌侵入宿主细胞。以往的研究发现在口腔龈上和龈下菌斑中大多数的细菌可以表达PC,如口腔链球菌、具梭核杆菌、伴放线放线杆菌、各种放线菌属及奈瑟菌属等。Schenkein等人发现携带PC的Aa菌株与不携带PC的Aa菌株致病力有明显差异。提示PC可能是Aa导致牙周病发生发展的一个重要的致病因子。然而,目前对于Aa细菌株上含有的磷脂酰胆碱通过哪些信号通路来介导了Aa对宿主细胞的黏附侵袭尚未见有人报道。本课题拟通过分离临床Aa菌株,筛选出PC阳性的Aa菌株,探讨PC介导Aa黏附侵袭宿主细胞的可能机制,为研究Aa的致病机制提供一定的理论基础。一、PC阳性的Aa菌株的分离及鉴定采集侵袭性牙周炎患者的牙周袋内的非附着性菌斑,接种于选择性培养基TSBV平板上,观察菌落的形态挑选可疑菌落,根据触酶试验阳性、革兰染色实验阴性及16SrDNA鉴定,筛选出伴放线放线杆菌临床分离株7株。将所得的临床菌株全细胞进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,考马斯亮蓝染色后观察细菌蛋白的表达。并采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细菌表面蛋白对磷脂酰胆碱单克隆抗体TEPC-15的反应情况,最终筛选出磷脂酰胆碱阳性表达的Aa菌株1株。二、PAFR在PC阳性Aa菌株致病过程中的作用研究1、PC对细菌黏附和侵袭的影响为了研究PC的表达在Aa黏附和侵袭人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)过程中的作用,我们采用抗PC的特异性单克隆抗体TEPC-15抗体预处理HUVEC30min后,分别与PC阳性和阴性的Aa临床分离株在37℃共孵育4h后,观察细菌的对HUVEC的黏附和侵袭情况。结果发现PC阳性的Aa临床分离株的黏附力和侵袭力均发生了显著下降(P<0.05),分别为对照组的31.87±4.22%和24.63±3.55%。而用TEPC-15抗体预处理细胞以后,PC阴性的Aa对HUVEC的黏附力和侵袭力则无显著差异(P>0.05)。2、PAFR对细菌黏附侵袭的影响为了研究PAFR是否参与了Aa对HUVEC的黏附和侵袭过程,我们利用PAFR拮抗剂(CV3988)和抗PAFR抗体作用于HUVEC30min后,进行了细菌的黏附和侵袭实验。结果发现100nm,200nm和500nm的PAFR拮抗剂预处理HUVEC,显著减少了PC阳性Aa对HUVEC的黏附和侵袭(P<0.001),黏附率分别为对照组的36.29±3.52%,19.04±3.35%和7.69±3.19%；侵袭率分别为对照组的12.12±1.58%,7.08±0.29%和2.60±2.26%。同样,用抗PAFR抗体预处理HUVEC后Aa对HUVEC的黏附率和侵袭率分别为50.05±5.28%和39.09±6.50%,显著降低了Aa对宿主细胞的黏附和侵入(P<0.001)。3、PAFR在细菌诱导细胞损伤中的作用研究我们用PAFR拮抗剂和抗PAFR抗体分别作用于细胞后,采用MTT法分析了PC阳性和阴性Aa诱导的细胞损伤情况。结果发现用200nm和500nm的PAFR拮抗剂和25μg/ml抗-PAFR抗体预处理HUVEC后,PC阳性的Aa与细胞作用以后,细胞的存活率显著升高(P<0.001),从25.39±9.33%分别升高到91.12±3.14%,94.12±2.15%和65.5±1.87%。我们同时对PC阴性的Aa进行了研究,发现预处理组与未预处理的组相比,PC阴性的Aa感染]HUVEC后,细胞活力并没有显著增加(P>0.05)。三、磷酸肌醇信号通路在PC阳性Aa菌株致病过程中的作用研究1、磷脂酶C被抑制后对细菌黏附侵袭过程的影响为了探讨G蛋白偶联受体通路是否参与了Aa黏附和侵袭到HUVEC的过程,我们采用磷脂酶C (Phospholipase C,PLC)与G蛋白偶联受体结合过程的抑制剂U73122和其无活性的类似物U73343预处理HUVEC,观察细菌对细胞的黏附和侵袭。结果发现U73122预处理组侵入到HUVEC的PC阳性的Aa降低为对照组的12.62±2.1%(P<0.001)；然而,细菌对细胞的黏附率却没有显著差异。与此同时,用U73343预处理细胞后,PC阳性的Aa对HUVEC的侵袭率和黏附率均没有表现出显著差异(P>0.05),表明U73343不能阻断PC与PAFR的结合及由此启动的信号传递。2、磷脂酶C被抑制后细菌对细胞损伤的影响分别用U73122和U73343预处理HUVEC30min后,与PC阳性的Aa进行作用2h,MTT法检测细胞存活的情况。U73122预处理HUVEC后,对PC诱导的细胞损伤表现出了显著的保护作用,]3UVEC的细胞存活率从39.31±6.43%升高到了93.09±5.46%。与此相反,U73343预处理与非预处理组之间,PC阳性的Aa感染HUVEC后所观察到的细胞存活率相似(P=0.664)。我们同时分析了PC阴性的Aa感染用U73122和U73343预处理HUVEC后的细胞存活率,发现U73122和U73343预处理组与未处理组之间细胞的存活率没有显著差异(P=0.520)。3、细胞内钙离子浓度的测定为了进一步证实U73122阻断了PLC与G蛋白偶联受体PAGFR的结合从而抑制了PC阳性的Aa侵入到HUVEC,用U73122预处理细胞后,我们采用fura2/AM检测了PC阳性的Aa侵入到HUVEC的过程中的细胞内Ca2+动员的情况。结果发现用U73122预处理细胞后几乎完全抑制了细胞内Ca2+浓度的增加(P=0.16)。四、Clathrin及β-arrestin-1/-2在PC阳性Aa致病过程中的作用研究1、clathrin被抑制后对细菌黏附侵袭的影响为了探讨网格蛋白(clathrin)和β-arrestins是否参与了Aa内吞入HUVEC的过程,我们研究了的网格蛋白的抑制剂在Aa黏附和侵袭HUVEC的过程中的影响。氯丙嗪(chlorpromazine, CPZ)、单丹磷酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)是网格蛋白在装配及循环再利用过程中的两个特异性抑制剂,用MDC和CPZ预处理细胞以后,PC阳性的Aa侵袭率分别降低为对照组的41.33±2.59%和43.22±2.67%(P<0.001)。然而,MDC或CPZ预处理组和未处理组之间,Aa对HUVEC的黏附率没有显著差异(P>0.05),表明MDC或CPZ对网格蛋白的抑制作用可能不能阻止Aa对细胞的黏附过程。2、β-arrestin-1和β-arrestin-2对Aa黏附侵袭的影响此外,为了证实β-arrestins参与了Aa内吞入HUVEC的过程,我们用siRNA的方法干扰了HUVEC细胞内的β-arrestins,然后将Aa作用于转染后的细胞,观察其对细胞的黏附和侵袭的情况。首先,我们检测了β-arrestin-1或-2的siRNA转染HUVEC后的细胞转染率及细胞内β-arrestins的表达水平。荧光显微镜下可以观察到细胞转染情况,转染率均在60%以上。P-arrestin-1或-2的siRNA转染后,与未转染组及阴性对照组相比,有针对性的降低了β-arrestins的表达。然后,用PC阳性的Aa作用于β-arrestins siRNA转染后的HUVEC,发现可有效地阻断Aa侵入到细胞内,侵袭率分别为对照组的53.12±2.81%和56.00±2.37%(P<0.001)。但是,黏附到细胞的细菌数没有显著差异(P=0.336),这表明β-arrestins siRNA不能抑制Aa的PC与细胞表面PAFR的结合。同时,阴性对照组siRNA转染细胞后,Aa对HUVEC的黏附和侵袭均没有显著差异。统计学分析数据均表示为均数±标准差,两组间的比较采用两独立样本t检验；与常数组之间的比较采用单样本t检验,用Bonferroni法校正检验水准；多组间比较采用单因素方差分析,不同处理组之间的两两比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’sT3法。相关性分析采用Spearman法。P<0.05认为差异有统计学意义。数据分析采用SPSS13.0软件。结论1、我们成功分离得到了Aal临床分离株并成功筛选出了磷脂酰胆碱阳性表达的Aa菌株,为下一步的实验提供了基础。2、PC有助于PC阳性的Aa对宿主细胞的黏附和侵袭；同时,PAFR在PC阳性的Aa对宿主细胞的黏附、侵袭及诱导胞损伤的过程中发挥了重要作用。3、PAFR介导的磷酸肌醇信号通路参与了PC阳性的Aa在黏附、侵袭细胞和诱导细胞损伤的过程。4、网格蛋白clathrin和P-arrestins参与了PAFR介导的表达PC的Aa对HUVEC的侵袭过程。