昆虫的生存环境非常特殊,为了生存和种群的繁衍,昆虫在长期与病原菌的斗争过程中形成了强大的免疫系统。昆虫为先天性免疫系统,它通过体内的模式识别受体识别外源病原物的保守特征,进而引起体液免疫和细胞免疫。具有抗菌作用的抗菌肽的合成就属于体液免疫而细胞免疫则包括吞噬作用和包裹作用等。病原物识别蛋白在昆虫的先天性免疫体系中具有重要作用。肽聚糖识别蛋白识别肽聚糖能引起抗菌肽的产生,另外葡聚糖识别蛋白识别葡聚糖也能引起类似的生理反应。除这两个研究比较清楚的识别蛋白家族外,还有其它类型的识别蛋白在昆虫对外界的免疫反应中也起着重要作用。　　 CIb1是从家蚕体液中纯化得到的具有胰凝乳蛋白酶抑制活性的Kunitz型蛋白酶抑制剂。近期的研究表明CIb1参与家蚕的免疫反应,具有脂多糖的结合活性。推测其可能介导外源物刺激的信号传导。　　 本研究旨在进一步了解CIb1在家蚕体内的功能,首先通过蛋白质的相互作用,获取其在体液中的结合蛋白。根据其N端氨基酸序列,克隆得到编码该蛋白的全长cDNA(命名为Bmhp20)。通过体外表达纯化Bmhp20蛋白,再对其功能进行分析。主要的研究结果如下:　　 1.家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂CIb1的纯化及与体液蛋白的相互作用　　 CIb1是碱性的小分子胰凝乳蛋白酶抑制剂,能够在体外抑制胰凝乳蛋白酶的活性。根据这些特点制定纯化策略,在纯化的过程中利用其胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性进行监测。首先利用硫酸铵进行沉淀,去掉部分杂蛋白。再根据CIb1的分子量和等电点通过凝胶层析和离子交换纯化。活性染色和质谱确定纯化的CIb1为具有活性的单一蛋白。CIb1用生物素标记后与家蚕的体液进行结合反应。Far-Western结果显示CIb1与未处理的家蚕体液蛋白不存在相互作用;但是CIb1与脂多糖刺激后的家蚕体液蛋白存在相互作用。　　 2.CIb1蛋白的原核表达、纯化及与体液蛋白的相互作用　　 将编码CIb1成熟蛋白的基因克隆到pDEST17中进行原核表达。将质粒转化Rosetta、Origami B(DE3)、BL21(DE3)、JM109(DE3)四种原核表达菌株后进行诱导表达。CIb1是具有3对二硫键的胰凝乳蛋白酶抑制剂,表达的蛋白要能够在原核系统体系中正确折叠才能进行下一步实验。通过胰凝乳蛋白酶抑制剂活性染色筛选后发现带有trxB和gor的双突变的origami B(DE3)能够表达出有活性的重组CIb1蛋白(rCIb1)。rCIb1在origami B(DE3)主要以包涵体的形式存在。将表达的包涵体形式的rCIb1用尿素助溶,S200凝胶柱进行纯化的同时进行复性。活性染色表明纯化的rCIb1蛋白具有活性。前面的实验已经证明CIb1能够与诱导后的家蚕体液蛋白发生相互作用。在rCIb1与脂多糖诱导24小时后的家蚕体液的pull down实验中,rCIb1在Ni-NTA柱上与体液蛋白发生相互结合反应。用漂洗缓冲液洗掉与Ni-NTA非特异结合的蛋白之后,用高浓度咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱,发现洗脱的高分子量蛋白能够用CIb1的抗体杂交显色。推测此处可能是CIb1与家蚕体液蛋白形成的复合体,此复合体具有SDS稳定性。通过电洗脱对蛋白进行分离并做N末端测序。测序得到该蛋白N端20个氨基酸为HGSSDVDGSGEVEAVAGTLK,分析表明该蛋白没有被前人研究过。　　 3.CIb1结合蛋白Bmhp20编码基因的全长克隆及表达分析　　 蛋白N端序列HGSSDVDGSGEVEAVAGTLK在家蚕数据库进行tBLASTn搜索,一个预测基因BGIBMGA002175的序列与之相匹配。根据该基因的EST序列,设计引物克隆并测序验证该基因,验证结果显示该基因序列与结合蛋白的测序序列相一致,证明克隆的基因就是结合蛋白的基因序列。再对基因的5’端进行克隆,得到全长序列。该基因全长740 bp,开放阅读框645 bp,编码215个氨基酸的肽段。N端18个氨基酸为信号肽区域,预测分子量为21.5 kDa,等电点为5.5。根据这个结合蛋白的分子量和蛋白存在的形式,命名为Bmhp20(基因登录号:GU015849)。Bmhp20基因由三个外显子和二个内含子构成。编码成熟蛋白的基因序列都在最后一个外显子上。NCBI Blast分析显示在其它物种中不存在与Bmhp20相类似的氨基酸序列。对氨基酸序列组成成分分析发现,Bmhp20主要由少数几种氨基酸构成,甘氨酸占氨基酸总量的26.9％,丝氨酸占13.2％,苯丙氨酸12.2％,天冬氨酸10.7％,组氨酸9.1％。在ELM数据库分析发现,Bmhp20富含氨基葡聚糖结合位点(DGSGE,DNSGF,NSGF,HSGF,DSGF,DSAL)。　　 家蚕五龄三天组织表达芯片分析表明Bmhp20基因的表达没有雌雄差异性,在头、体壁、脂肪体和卵巢四个组织有表达。这个结果与RT-PCR分析的Bmhp20表达情况相一致。用RT-PCR分析Bmhp20基因在家蚕整个发育时期的表达结果显示,Bmhp20基因在家蚕的整个幼虫期都有高量表达。在上蔟的第一天表达量高,之后受到抑制。在化蛹第四、五天又出现一个高量表达峰。　　 由于CIb1参与家蚕的免疫反应,而CIb1与Bmhp20在外源物刺激下发生相互作用,推测Bmhp20可能也参与免疫反应。家蚕用大肠杆菌、黑胸败血芽孢杆菌、白僵菌刺激后,定量RT-PCR检测Bmhp20的mRNA在脂肪体的表达变化。与对照相比,在注射大肠杆菌后1小时,Bmhp20的mRNA迅速上升,随后表达受到抑制。在白僵菌的刺激下,Bmhp20的表达也是迅速上升,在3、6小时受到抑制,在12小时的时候表达又发生上调。对Bmhp20的表达影响最大的黑胸败血菌,它对Bmhp20的影响比其它两种病菌都要高,且在24小时达到最大。Bmhp20基因对黑胸败血芽孢杆菌的强烈反应可能暗示该基因在家蚕应对其主要细菌性败血病原(黑胸败血芽孢杆菌)时起着重要作用。　　 4.His-Bmhp20融合蛋白的原核表达、纯化及抗体的制备　　 将编码Bmhp20成熟蛋白的基因克隆到pET28a载体上,Bmhp20基因有大量的稀有密码子,选用Rosetta菌株进行表达。诱导蛋白成分分析表明,Bmhp20蛋白在Rosetta菌株中能够以可溶形式表达,这有利于后续对蛋白功能的研究。表达的蛋白带有六个组氨酸的融合标签,用Ni-NTA树脂进行亲和纯化,再通过Superdex75凝胶柱对样品进行进一步的纯化。Bmhp20蛋白的氨基酸组成中有大量组氨酸,为消除六个组氨酸的融合标签可能造成的实验影响,需要对标签进行切除。将纯化的带标签的蛋白His-Bmhp20用凝血酶进行消化,消化完后凝血酶残留用streptavidin Agarose去除,切开的六组氨酸标签使用Superdex75凝胶层析去除,得到纯的Bmhp20。用Bmhp20免疫成年公兔,制各多克隆抗体,检测效价达到1:100000后取血清,抗血清纯化后保存于-30℃备用。　　 5.Bmhp20的功能分析　　 1)Bmhp20蛋白合成后分泌于家蚕体液中　　 Bmhp20的氨基酸序列分析显示其具有氨基葡聚糖结合位点,可能参与家蚕的免疫识别。家蚕五龄三天幼虫的各组织蛋白的Bmhp20免疫杂交显示Bmhp20信号只在家蚕体液中出现,其它组织均检查不到Bmhp20。同时Bmhp20是在家蚕体液中鉴定出来的与CIb1有相互作用的蛋白,这些都表明Bmhp20是在家蚕体液中存在并行使功能的蛋白。　　 2)Bmhp20不具有水解酪蛋白的功能　　 Bmhp20与胰凝乳蛋白酶抑制剂CIb1能相互结合,首先考虑Bmhp20在家蚕体内可能作为水解酶并调控家蚕的生理反应,由CIb1控制其反应的程度。在体外测试Bmhp20的酶活性,结果表明Bmhp20不具有水解酪蛋白的活性。推测Bmhp20不是以酶,而是以其它的形式参与家蚕对外界的免疫应答。　　 3)Bmhp20蛋白在大肠杆菌刺激后的体液中含量降低　　 家蚕用大肠杆菌、黑胸败血芽孢杆菌、白僵菌刺激后,离心收集体液,检测Bmhp20在体液中的存在情况。Western blotting结果表明家蚕受黑胸败血芽孢杆菌、白僵菌刺激后,体液中Bmhp20的含量变化不大。然而大肠杆菌刺激后,Bmhp20的含量随着刺激时间的增加而减少。分析原因,可能因为检测物为离心后的家蚕体液蛋白,由于CIb1能够与大肠杆菌结合,推测在脂多糖刺激后CIb1与Bmhp20产生相互作用,因此导致体液中游离的Bmhp20没有得到及时的补充而出现蛋白量的减少。　　 4)Bmhp20在体外能够结合多糖和革兰氏阳性菌、真菌　　 体外结合实验证明Bmhp20在体外能够与几丁质、纤维素、凝胶多糖相结合。Bmhp20与革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、黑胸败血芽孢杆菌)、阴性菌(粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌)及真菌(白僵菌、毕赤酵母)的结合实验表明Bmhp20能够与革兰氏阳性菌和真菌结合。这一结果暗示Bmhp20可能在家蚕免疫应答中起着模式识别的作用。　　 5)Bmhp20不参于细胞吞噬作用　　 Bmhp20蛋白分别与FITC标记的金黄色葡萄球菌和白僵菌孵育后,体外观察Bmhp20是否会促进家蚕血细胞对金黄色葡萄球菌和白僵菌的吞噬作用。结果表明Bmhp20不具备促进细胞的吞噬作用。将FITC标记的金黄色葡萄球菌和白僵菌注入家蚕体内1小时后取出血细胞在荧光显微镜下观察,血细胞对FITC标记的细菌产生吞噬作用,但与Bmhp20无关。体内体外实验证明,单一的Bmhp20蛋白不参于细胞吞噬作用。　　 6)Bmhp20参与抑制家蚕黑化反应　　 家蚕幼虫体液试剂(SLP)是用家蚕体液制成的检测试剂。加入葡聚糖或肽聚糖能够引起黑化反应。采用SLP试剂进行的黑化抑制实验表明,与葡聚糖或肽聚糖直接刺激引起黑化反应相比,预先加入Bmhp20能够显著抑制黑化反应的发生。这一结果证明Bmhp20具有抑制家蚕黑化反应的作用。