蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase，SPase）是一种能够特异性转移葡萄糖苷键的酶，该酶能够以蔗糖和葡萄糖-1-磷酸为供体，催化各种糖类及非碳水化合物受体进行转糖苷反应，合成一系列具有不同功能的糖苷类化合物。由于糖苷类化合物在食品、医药、化妆品等行业的广泛应用，获得一种催化活性高、稳定性好的蔗糖磷酸化酶成为人们的研究重点。参照NCBI公布的来源于长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的晶体结构，对其进行生物学信息分析，从中得到保守序列中四个氨基酸位点，并利用全质粒PCR对其进行体外定点突变。突变后得到蔗糖磷酸化酶的4个突变体：Phe156Ala(F156A)、Tyr196Ala(Y196A)、Asp342Ala(D342A)、Gln345Ala(Q345A)。对突变体进行异源表达经SDS-PAGE检测结果表明，突变体的可溶性表达量并没有发生明显的变化，产生的可溶性蛋白约占总蛋白量的60%。由于野生型蔗糖磷酸化酶及突变体均带有6个组氨酸的His标签，因此采用镍亲和层析的方法对可溶性蛋白进行纯化进而获得大量较高纯度的目的蛋白。纯酶的酶学性质表征显示，野生型SPase及突变体酶在30℃，pH7.0条件下，对500mM蔗糖进行糖基化反应测定野生型SPase的酶比活可以达到201U/mg，分别是突变体F156A、Y196A、D342A、Q345A的169.0、21.8、775.4、50.25倍。动力学数据分析表明，在糖基化反应中突变体的Km值与野生型SPase相比明显增大，其中D342A约是野生型的27倍，其余突变体的增加量是野生型SPase的7倍左右。对Kcat/Km进行比较野生型SPase分别是突变体F156A、Y196A、D342A、Q345A的1086、125、15000及2700倍。在以无机磷酸盐为变量，蔗糖恒定为500mM进行解转糖基反应动力学测定时，突变体F156A、Y196A、Q345A的Km值大约分别是野生型SPase的12、40和4倍，而突变体D342A的Km值并没有发生明显的变化。过渡态自由能测定得到，突变体F156A、Y196A、D342A、Q345A由蔗糖引起糖基化反应形成葡萄糖基化酶中间过渡态所需自由能与野生型相比G#分别为4.2kcal/mol、2.9kcal/mol、5.8kcal/mol、3.4kcal/mol，而由Glc1P引起的糖基化反应与野生型SPase相比G#分别为4.0kcal/mol、3.0kcal/mol、3.8kcal/mol、2.9kcal/mol。由此可以说明，突变体在催化形成中间过渡态的过程中所需要的中间过渡态自由能均高于野生型，从而阻碍了突变体的催化过程。通过对突变体酶学性质的表征发现突变体D342A、Q345A的最适pH值与野生型相比没有发生改变，F156A、Y196A的最适pH值偏移了1.5个单位。相对于野生型SPase来说四个突变体均显示了较差pH值耐受性。研究温度对酶的影响,得到突变体F156A、Y196A、D342A的最适反应温度均低于野生SPase，而Q345A的最适反应温度比野生型SPase高5℃。对在不同温度下孵育1h后的酶进行热稳定性试验得到，突变体F156A、Y196A、D342A、Q345A的半衰期温度分别比野生型SPase高出9℃、9.5℃、6℃及10℃。金属离子稳定性试验表明，突变体的金属离子稳定性都要高于野生型SPase，其中，Cu2+、Mn2+离子对酶稳定性的影响差别最为显著。综上所述，氨基酸Phe156、Tyr196、Asp342、Gln345经“丙氨酸扫描”后证实是长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶催化磷酸化反应中重要的活性位点，经突变后对酶活的影响较为显著。这为今后蔗糖磷酸化酶催化磷酸化反应机理和高效酶活菌株的进一步研究奠定了基础。